糖化血红蛋白的单克隆抗体制备及鉴定

基础医学・　中国现代医生２０１５年４月第５３卷第１１期　糖化血红蛋白的单克隆抗体制备及鉴定　

项岳晖　卢玲玲　涂斐佩　陈建胜　张新卫　１．浙江省瑞安市中医院眼科，浙江瑞安３２５２００；２．浙江省疾病预防控制中心，浙江杭州３１００００　

【摘要】目的采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定，为开发糖化血红蛋白ＥＬＩＳＡ试　剂盒提供特异性材料。方法通过用顺丁烯二酰亚胺法制备免疫抗原，通过ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行多层次免疫，通过　细胞培养融合，ＨＡＴ培养基筛选杂交瘤细胞，使用Ｇ蛋白层析法、硫酸铵盐析法等对细胞进行纯化。单抗亚类鉴　定采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒。结果通过细胞融合、培养、筛选、克隆等，最后筛选出１株能稳定分泌　特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为Ｎ５Ｂ４；细胞培养上清液体效价为１：５０００，腹水效价为１：１００万；通过标准曲　线计算样品中人糖化血红蛋白的浓度为９９．２％。结论经过筛选获得高特异性、高灵敏度的ＫＥＴ单克隆抗体细　胞株。　【关键词】糖化血红蛋白；单克隆抗体；糖尿病黄斑水肿　【中图分类号】Ｒ４４６．６　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７３—９７０１（２０１５）１　１—００２２—０３　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｇｌｙｃａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ＸＩＡＮＧ　Ｙｕｅｈｕｉ　ＬＵ　Ｌｉｎｇｌｉｎｆ　ＴＵ　Ｆｅｉｐｅｉ　ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎｓｈｅｎｆ　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｎｗｅｉ　１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｒｕｉａｎ　Ｃｉｔｙ　ｉｎ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｒｕｉａｎ　３２５２００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１００００，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｔａｂｌｙ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ａｎｔｉ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ｍｅｔｈｏｄ，ｍｕｌｔｉ—ｌｅｖｅｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ＢＡＬＢ／ｅ，　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｕｓｉｏｎ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ＨＡＴ，ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｓａｌｔｉｎｇ　ｏｕｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｉｄｅｎｔｉ—　ｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｅｔｃ．，ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　１　ｓｔｒａｉｎ　ｓｔａｂｌｙ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｈｙｂｆｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ，ｎａｍｅｄ　Ｎ５Ｂ４；ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｌｉｑｕｉｄ　ｗａｓ　１：　５０００，ａｓｃｉｔｅｓ　ｔｉｔｅｒ　ｗａｓ　１：１００　ｍｉｌｌｉｏｎ；ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｙｃａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｗａｓ　９９．２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｆｔｅｒ　ＫＥＴ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ａ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎ—　ｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｍａｃｕｌａｒ　ｅｄｅｍａ　

糖化血红蛋白（ＨｂＡ　ｌ　ｃ）是一种非酶糖化产物。其对　氧的亲和力明显高于正常的血红蛋白．血液中ＨｂＡｌｃ　水平增高会阻碍氧在组织中扩散，导致组织缺氧坏死。　ＨｂＡｌｃ水平增高也会加重视网膜缺氧状态，进一步　加重毛细血管扩张，渗漏明显增加，最终导致ＣＳＭＥ　加重和治疗效果不佳ｌｌ’　。研究表明，ＤＭＥ治疗效果　仅与ＨｂＡｌｃ水平有关，血糖水平的高低对其无明显　影响．这可能与ＨｂＡｌｃ的水平反映测定前８　ｌ２周　血糖的平均水平，血糖浓度的波动对其影响不大，因　此．是一项评估糖尿病控制效果的重要指标［３１。因此检　测ＨｂＡｌｃ的水平，对于临床治疗糖尿病性黄斑水肿　【基金项目】浙江省卫生适宜技术成果转化计划Ａ类（２０１　１　ＺＨＡ００３）　ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴＯＲ　Ｖｏ１．５３　Ｎｏ．１　１　Ａｐｒｉｌ　２０１　５　有极其重要的意义。本研究利用杂交肿瘤技术制备并　筛选出高特异性、高灵敏度的ＫＥＴ单克隆抗体细胞　株，为开发糖化血红蛋白ＥＬＩＳＡ试剂盒提供特异性材　料，现报道如下。　

１资料与方法　１．１一般资料　试验动物为ＢＬＡＢ／ｃ小鼠２０只。均购自上海中　科院下属单位上海斯莱克试验动物中心，周龄８～ｌＯ周，　雌雄各ｌ０只。　１．２方法　１．２．１抗原制备多肽链Ｎ末端缬氨酸上的氨基与葡　萄糖Ｃ１发生糖基化。Ｃｙｓ（ＳＨ）用于偶联载体蛋白，用　中国现代医生２０１５年４月第５３卷第１１期　顺丁烯二酰亚胺法分别偶联ＫＬＨ和ＢＳＡ，制备出我们　所需要的免疫抗原。　１．２．２动物免疫取８～ｌ０周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠２０只，　将免疫抗原采用多层次动物免疫方法进行免疫，融　合前３　ｄ进行１次强化免疫，增加剂量，不要使用　佐剂。　１．２．３细胞融合细胞融合过程中应注意几个问题：　①细胞的比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从１：２～　１：１０不等。常用１：４。②反应时间。③培养液的成分。　实验具体操作如下：将Ｓｐ２／ｏ细胞和脾细胞混合，离心，　取上清，轻轻摇散底部细胞，慢慢加入ＰＥＧ（１５０％，　０．７　ｍＬ）加完后迅速加入２５　ｍＬ不含血清的培养基以　稀释ＰＥＧ（３７％水浴进行），ＰＥＧ可以造成细胞膜一　定程度的损伤，使细胞易于相互黏连而融合在一起，　８００　ｒｐｍ／ｍｉｎ离心７　ｍｉｎ，弃上清，加入ＨＡＴ培养基，　再加到含有饲养细胞的９６孔板内，１００　Ｉ／孑Ｌ，５％　ＣＯ２、３７℃培养。　１．２．４杂交瘤细胞筛选及克隆化培养采用间接ＥＬＩＳＡ　法对融合后的细胞进行阳性杂交瘤细胞筛选，将筛选　出来的细胞进一步使用有限稀释法进行克隆，然后进　行扩大培养，收集并冻存，对其进行鉴定。　１．２．５单克隆抗体的制备及效价测定选择２０只小　鼠．使用１　ｍＬ注射器将０．５　ｍＬ液体石蜡注入小鼠腹　腔，培养１周后，将杂交瘤细胞注射进入小鼠腹腔，剂　量为（１－２）ｘｌＯ　个／只，１周后观察小鼠腹腔腹水生成　情况，使用注射器抽取１－２　ｍＬ腹水，离心，取上清液。　采用间接ＥＬＩＳＡ法测定效价，以Ａ值大于阴性的２．１　倍的稀释比例的倒数为该抗体效价，一２０％冻存腹水。　１．２．６单克隆抗体的纯化及亚类鉴定使用硫酸铵盐　析法和Ｇ蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化，按照小鼠　单克隆抗体亚型试剂盒说明书进行操作鉴定。　１．３统计学方法　使用ＳＰＳＳ２　１．０软件包对数据进行处理，计数资料　采用Ｘ。检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结果　２．１细胞融合及筛选　通过细胞融合、培养、筛选、克隆等，最后筛选出　１株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株．命名为　Ｎ５Ｂ４。见表１。　・基础医学・　表１两次检查结果前后的比较　注：与第２次比较，　０．０５　２．２单抗的最大稀释度和腹水效价的测定　细胞培养上清液体效价为１：５０００，腹水效价为　１：１００万。　２．５单克隆抗体鉴定　用酶标仪在４５０　ｎｍ波长下测定吸光度ＯＤ值。　通过标准曲线计算样品中人糖化血红蛋白的浓度为　９９．２％，不同浓度样品存放一２０％放置３个月稳定性较　高，见表２。　

表２样品在一２０℃放置３个月稳定性（ｎ＝２０）　

３讨论　ＨｂＡｌｃ是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血　糖结合的产物，在血液中的浓度与血糖浓度呈正比，且　不能进行可逆性结合。其随着红细胞消亡而消失，通　过检查ＨｂＡｌｃ可以评估采血前２～３个月血糖的平均　水平。ＨｂＡｌｃ与人体内的代谢有密切关系，当其浓度　升高时，可影响红细胞对氧的亲和力，其与氧结合能　力较强。容易引起组织与细胞缺氧，导致组织与毛细　血管坏死，加速心脑血管并发症的形成。ＨｂＡｌｃ浓度　升高可引起肾小球增厚，引发糖尿病肾病。另外其还　能引起血脂和血粘滞度增高，增加心血管疾病发生的　风险。因此监测ＨｂＡｌｃ在糖尿病患者病情控制、并发　症预测、糖尿病患者筛选等方面具有非常重要的作用。　国际上已经明确将ＨｂＡｌｃ作为糖尿病监测的金标　准，由于检测方法尚未完全统一，我国还未将其作为　糖尿病的诊断标准。目前临床上对确诊的糖尿病患者　进行ＨｂＡｌｃ检测，主要目的在于了解患者近期血糖　控制效果．为临床治疗提供参考。将ＨｂＡｌｃ检测结果　作为糖尿病病情控制的指标．对糖尿病高危人群开展　ＨｂＡｌｃ检测，可以早期发现糖尿病患者，并对其进行　早期治疗。　本研究通过采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白　的单克隆抗体并对其进行鉴定，为开发糖化血红蛋白　

ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴＯＲ　Ｖｏ１．５３　Ｎｏ．１　１　Ａｐｒｉｌ　２０１　５