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植物二氢黄酮醇4—还原酶的生物信息学分析

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植物二氢黄酮醇4—还原酶的生物信息学分析

作者：郝爱平

来源：《江苏农业科学》2014年第06期

摘要：二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是黄酮类化合物合成途径中的重要酶之一。利用NCBI数据库中已经注册的植物DFR基因核酸以及氨基酸序列，以拟南芥DFR为主，对其组成成分、疏水性/亲水性、蛋白质的二级结构以及三级结构等方面进行分析及预测，结果表明：拟南芥等植物DFR不具有明显的疏水或亲水区域；主要构件为α-螺旋和不规则卷曲；植物DFR在高级结构、活性位点等方面具有较高的保守性。

关键词：二氢黄酮醇4-还原酶；生物信息学；黄酮类合成

中图分类号： Q554文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0030-04

收稿日期：2013-09-16

基金项目：牡丹江师范学院青年学术骨干项目（编号：G201210）。

作者简介：郝爱平（1979—），女，山东莘县人，硕士，讲师，研究方向为分子生物学。E-mail：swxhap@。随着人们生活水平的提高，对花卉的需求量也越来越大，花卉市场有着越来越广阔的发展前景。花色和果色是植物的重要遗传性，决定花卉和果实的商品性和价值性[1]。花卉的品种和色泽是育种中最为关键的因素，传统的育种技术选育稀有花色品种的难度很大，不断成熟的基因工程育种为花卉新品种的选育开辟了一条有效的途径[2]。二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素合成过程中的关键酶，决定植物的颜色、叶色和果色。本研究运用生物信息学的方法，以拟南芥DFR为重点，对葡萄、小麦、玉米、大豆等植物的DFR基因及其推导的氨基酸序列的组成、理化性质、结构特征及功能等方面进行预测和分析，以期为今后进一步深入开展该酶的相关研究提供理论依据。1材料与方法

1.1材料

数据资料来源于National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸及蛋白质数据库中已注册的植物二氢黄酮醇 4-还原酶的核酸序列及其对应的氨基酸序列：葡萄（XP_002281858.1）、拟南芥（NP_199094.1）、玉米（NP_001152467.1）、小麦（CAW59975.1）、大豆（NP_001238612.1）。

1.2方法 龙源期刊网

根据DNAStar、ClustalW软件及相关网站提供的生物信息学软件分析核酸、氨基酸序列的组成、理化性质及亲水性/疏水性、蛋白质的二级和三级结构。表1软件名称和地址

名称地址Protparamhttp：///protparamBlasthttp：///Blast.cgiProtscalehttp：///protscale/SOPhttp：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.htmlORFhttp：///projects/gorf/SWISS-modelhttp：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html

2结果与分析

2.1不同植物DFR基因蛋白质理化性质分析用DNAStar软件分析DFR基因核苷酸序列及氨基酸序列，结果表明：不同植物的DFR的基本组成存在一定的差异，拟南芥DFR的ORF为1149bp，推导氨基酸分子量表2不同植物DFR基因编码氨基酸序列的组成成分及理化性质分析

物种ORF

（bp）推导氨基

酸残基数（个）分子量

（ku）pI氨基酸比例（%）酸性氨基酸碱性氨基酸疏水性氨基酸极性氨基酸蛋白不稳定性

系数拟南芥1 14938245.875.3513.0910.7323.9827.2337.63葡萄1

12837541.936.3311.7310.9335.4725.0739.92玉米1 07435738.795.4812.3210.0838.1020.7335.53大豆1 04434738.857.5412.6812.9735.4521.3339.44小麦1

17339062.676.1411.7910.5137.6920.7734.57

为45.87 ku，pI为5.35；小麦的ORF长度最长（1 173 bp），分子量最大（62.67 ku）；大豆的pI最大，为754，拟南芥的pI最小， 为5.35。拟南芥、葡萄、玉米、小麦DFR中酸性氨基酸含量要高于碱性氨基酸，而大豆的DFR碱性氨基酸含量微高于酸性氨基酸，这5种植物DFR都属于相对稳定类的蛋白质。

2.2不同植物DFR基因核酸及氨基酸序列比对分析

用Blast程序对拟南芥DFR的核酸及氨基酸序列进行同源性比对，结果表明拟南芥的核酸序列与紫菜薹（gb|ABQ81927.1）、荠菜（gb|EOA14701.1）、夏堇（dbj|BAJ16335.1）、美洲山杨（gb|AAN63056.1）、彩叶草（gb|ABP57077.1）、红花油菜（gb|AFC37249.1）、毛果杨（ref|XP_002307667.1）、陆地棉（gb|ACV72642.1）、芍药（gb|AFI71899.1）、黑核桃龙源期刊网

（emb|CAB94914.1）同源性较高，分别为60%、93%、61%、54%、74%、68%、54%、66%、66%、67%。

用Clustal W程序对拟南芥、葡萄、玉米、小麦、大豆5种氨基酸序列进行了多序列的比对，比对结果表明，植物DFR的N-端区域并没有同源性，而在这个区域后是高度同源的区域（即DFR的功能区段）。拟南芥等植物DFR在活性位点上表现的非常保守，推测不同植物的DFR具有很高的同源性。

2.3DFR蛋白疏水性/亲水性预测和分析

自然界中存在的20种常见氨基酸都具有疏水/亲水性，它们的排列顺序和侧链基团的互相作用共同决定了蛋白质的三维空间结构，通过对蛋白质的疏水性/亲水性进行预测和分析，可以为蛋白质的高级结构预测提供一些理论上的参考。用ProtScale对拟南芥、葡萄、小麦、大豆、玉米5种植物的DFR蛋白进行疏水性/亲水性预测，结果见图2至图6。

图2表明：拟南芥的多肽链在第139位上具有最低分值-2.447，在第188位上具有最高的分值2.500，即在多肽链上第139位亲水性最强、第188位疏水性最强，但在总体上多肽链并没有过于明显的亲水或疏水性区域。对葡萄、小麦、大豆、玉米的DFR蛋白的疏水性/亲水性进行预测也得到了类似的结果。因此可以推断，植物DFR中不存在特别明显的亲水或疏水的区域。

2.4DFR蛋白二级及三级结构预测和分析

蛋白质的一级结构即氨基酸残基的排列顺序决定了其高级结构，并且它的生物学功能又是由高级结构决定的。对蛋白质高级结构的预测和分析，有助于理解蛋白质的结构与功能之间的相关性。使用SOPMA对拟南芥、小麦、葡萄、大豆的DFR蛋白的二级结构进行了预测，结果见图7。

表3表明，拟南芥DFR的二级结构由36.65%的α-螺旋、14.14%的延伸链、6.81%的β-折叠以及42.41%的不规则卷曲构成，α-螺旋和不规则卷曲为最主要的元件。大豆、葡萄、小麦、玉米的二级结构与拟南芥基本相似，三级结构模型预测结果表明：拟南芥、大豆、小麦DFR空间结构十分相似，推测植物的DFR结构比较保守。

3讨论

花色是衡量观赏植物的重要标准之一，改变花色一直是转基因花卉研究比较热门的问题。花色主要是由类黄酮（flavonoid）、类胡萝卜素（carotenoid）和甜菜色素（betalain）三大色素决定[3]。黄酮类化合物是一类以C6—C3—C6碳骨架为

表35种植物预测的DFR蛋白二级结构构成比例 龙源期刊网

物种α-螺旋

（%）延伸区

（%）β-折叠

（%）不规则卷曲

（%）拟南芥36.6514.146.8142.41大豆35.4716.538.8039.20葡萄41.0316.156.4136.41小麦40.6313.266.9239.19玉米37.5413.737.5641.18

基本组成的天然化合物，分布广泛，种类繁多，结构复杂。据统计，植物体内的黄酮类化合物多达8 000余种，不仅能够参与花色的形成、花粉的发育，在雄性育性、细胞周期的调节和植物激素的传送等生理功能方面也有重要作用，还具有抗炎、抗癌、抗氧化、保护心脑血管系统等多种药理作用[4-6]。花青素是一类重要的黄酮类化合物，广泛存在于被子植物，是植物花、叶和果实红色、紫色、蓝色形成的物质基础。二氢黄酮醇4-还原酶是花色素苷合成过程中的第一个至关重要的酶，它是将二氢堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）、二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin，DNM）等作为反应的底物，在辅助因子NADPH的作用下可以把第4位的羰基转换还原为羟基，以转化生成相对应的不稳定的无色花青苷元，然后这些生成的无色花青苷元在花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和类黄酮3-O-糖基转化酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT）催化下分别形成花青素（红色粉红色）、花葵素（橙色砖红色）、花翠素（蓝紫色），与花色的产生直接相关[7]。

DFR属于NADPH依赖性的短链DFR还原酶超家族，最早于1985年由OReilly等从玉米（Zea mays）和金鱼草（Antirrhinum majus）中分离出来。随后，Beld等又在1989年以部分金鱼草DFR表型突变基因为探针分离了矮牵牛（Petunia hybrida）DFR基因。至今，通过同源克隆等方法，已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、兰花（Bromheadia finlaysoniana）、山茶（Camellia sinensis）、番茄（Lycopersicon esculentum）、水稻（Oryza sativa）、马铃薯（Solanum tuberosum）、非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）、玫瑰（Rose rugosa）、香石竹（Dianthus caryophyllus）、百合（Lilium brownii var. viridulum）等多种植物中成功分离出了DFR基因[8]。

经过科学家们研究发现，DFR基因的全长包括5′、3′非编码区和1个开放阅读框，由于来源于多种不同的植物，造成DFR基因的非编码区长度差异都比较大，致使它们的全长从1 272

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金银花类药用植物IspE和IspH基因克隆和生物信息学分析

金银花类药用植物IspE和IspH基因克隆和生物信息学分析

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金银花类药用植物IspE和IspH基因克隆和生物信息学分析

作者：汪周勇,蒋超,袁媛,陈平

来源：《中国中药杂志》2013年第01期

[摘要]目的：克隆金银花类药用植物4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase，IspE）和4-羟基-3-甲基-2-邻苯基二磷酸还原酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，IspH）基因，并对其基因序列、蛋白特性和转录活性进行分析、比较。方法：从忍冬Lonicera japonica转录组测序结果中分析获得了IspE，IspH基因。分别以忍冬、红白忍冬L. japonica var. chinensis、红腺忍冬L. hypoglauca和水忍冬L. dasystyla新鲜花蕾为材料，利用RT-PCR技术克隆获得了4种金银花类药用植物IspE和IspH基因的全长cDNA。运用生物信息学分析软件，预测编码蛋白的结构和功能，并通过RT-PCR检测IspE和IspH在忍冬、红白忍冬、红腺忍冬、水忍冬花蕾中的转录情况。结果：金银花类药用植物IspE基因含有1个完整的开放阅读框，长度为1 221 bp，编码406个氨基酸；IspH含有一个完整的开放阅读框，长度为1 380 bp，编码459个氨基酸。IspE和IspH均为非分泌蛋白，均定位于叶绿体中。RT-PCR分析结果表明在忍冬、红腺忍冬和水忍冬的花蕾中IspE，IspH基因的转录水平没有显著差异，但红白忍冬花蕾中IspE，IspH基因的转录水平均显著高于忍冬。结论：克隆获得忍冬、红白忍冬、红腺忍冬和水忍冬中IspE，IspH基因，并证实了其在不同金银花类药用植物中的表达，为进一步研究IspE，IspH基因对萜类化合物生物合成和花香气以及颜色的影响奠定了基础。

黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析

黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析

黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析

李萍;王若曦;王欢

【摘 要】通过生物信息学分析方法,对已经在GenBank上注册的青稞( Hordeum

vulgare)、高粱( Sorghum bicolor)、小麦( Triticum aestivum)、玉米( Zea

mays)、洋葱( Allium cepa)、花烛( Anthurium andraeanum)和美丽百合( Lilium specio-sum)等7种单子叶植物的F3H核酸以及相应氨基酸序列进行研究,并对其组成成分、理化性质、信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、蛋白质二级、三级结构、结构域以及分子进化等方面进行分析与预测. 研究结果表明,除玉米F3

H蛋白定位于过氧化物酶体外,其他植物F3 H均定位于细胞质基质内;所有植物F3

H均为不含信号肽的非分泌型蛋白,且没有跨膜区域的亲水性蛋白;α-螺旋和无规则卷曲是F3 H的主要二级结构元件,而延伸链则散布于整个蛋白中;F3H拥有一个2OG-Fell Oxy super family和一个PLNO3176 super family保守结构域;所构建的F3H系统发育进化关系与形态学上物种发育关系基本吻合.%In this paper, F3H,

sequences from Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Triticum aestivum,

Zea mays, Allium cepa, An-thurium andraeanum and Lilium speciosum,

which were registered in GenBank, were analyzed and predicted by tools

of bioinformatics in the following aspects:composition, physical and

chemical properties, signal peptide,protein subcellular localization,

4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶

4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶

4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶

4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶（4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate

reductase，简称HDR）是一种酶，参与了植物的异戊烯基二磷酸（IPP）和胆固醇生物合成途径中的重要步骤。

HDR酶催化反应的产物是异戊烯基二磷酸（IPP）。IPP是一种关键的中间体，参与多种生物合成途径，例如植物的植物甾醇和类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）合成。这些化合物在植物体内发挥着重要的生理功能。

HDR酶在植物体内通过将4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸（HMBPP）还原为IPP，来催化反应。这一催化过程通常需要辅酶NAD(P)H的参与，将HMBPP还原为IPP并生成二磷酸产物。

由于HDR酶在异戊烯基二磷酸（IPP）合成途径中的重要作用，对该酶的研究有助于了解植物生物合成途径的调控机制，以及开发相关药物和农业生物技术应用。

黄酮类化合物合成途径及合成生物学研究进展

黄酮类化合物合成途径及合成生物学研究进展

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黄酮类化合物是来源于植物的一类重要的次生代谢产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多种药理作用。黄酮类化合物的主要合成途径已经研究得比较清晰，即首先合成二氢黄酮类的柚皮素或松属素，然后进一步通过分支途径合成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等。黄酮生物合成途径的解析为其合成生物学研究奠定了基础。利用合成生物学技术已成功在大肠杆菌或酵母中合成了黄酮类化合物，如柚皮素、松属素和非瑟酮等。合成生物学研究为黄酮类化合物提供了新的来源，将进一步推动黄酮类药物和保健品的研发，使其在人类饮食和健康等领域发挥更大的作用。

标签： 黄酮类化合物； 合成途径； 合成生物学

Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biology

ZOU Liqiu1， WANG Caixia2， KUANG Xuejun1， LI Ying1， SUN Chao1*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical

Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical

Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Flavonoids are the valuable components in medicinal plants， which

possess a variety of pharmacological activities， including antitumor， antioxidant