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一种构建全长cDNA文库的方法

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cDNA和基因组文库DNA的构建

cDNA和基因组文库DNA的构建

结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.

cdna文库的构建和测序方法

cdna文库的构建和测序方法

cdna文库的构建和测序方法**CDNA Library Construction and Sequencing Methods**The construction of a cDNA library is a fundamental technique in molecular biology, enabling researchers to isolate, clone, and study specific genes. The process begins with the isolation of mRNA from a target cell or tissue. This mRNA is then reverse-transcribed into cDNA using a reverse transcriptase enzyme. The resulting cDNA fragments are subsequently cloned into a suitable vector, such as a plasmid or bacteriophage, to form a recombinant DNA molecule. These recombinant molecules are then introduced into host cells, typically bacteria, for amplification and storage.cDNA文库的构建是分子生物学中的一项基础技术，它使研究者能够分离、克隆和研究特定的基因。

该过程始于从目标细胞或组织中分离出mRNA。

随后，使用逆转录酶将这种mRNA逆转录成cDNA。

接着，将得到的cDNA片段克隆到合适的载体中，如质粒或噬菌体，形成重组DNA分子。

然后，这些重组分子被引入宿主细胞，通常是细菌，进行扩增和保存。

**Sequencing of cDNA Library**Once the cDNA library is constructed, sequencing becomes the next crucial step. Sequencing technologies have evolved significantly in recent years, with next-generation sequencing (NGS) platforms becoming increasingly popular. NGS allows for high-throughput sequencing, generating millions of reads in a short time. Thesereads are then aligned to a reference genome or transcriptome, enabling the identification and analysis of individual genes and gene expression patterns.cDNA文库构建完成后，测序成为下一个关键步骤。

cDNA文库的构建

cDNA文库的构建
建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转 录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当 的A的提纯获取一条链的合成。
PCR基因扩增
• 目的：增加目的DNA的数量
过程：
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒， 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序： • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
蓝白斑筛选：• 找出需构建的目的（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链c提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请 戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料，并充分混匀。

cDNA文库的构建与筛选

cDNA文库的构建与筛选
因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发 育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控 等生命现象的研究中具有更为广泛的生物特定的组织器官或特定发育 时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重 组分子，在该重组分子群集中包含了其小了分离功能基因的范围，同时分离的cDNA克隆 由于不含内含子，其序列可以给出蛋白质序列信息， 对于功能基因的研究更为方便，所以cDNA构建 也是基因工程研究的重要内容。
Your Top3、cDNA的合成
cDNA第一链的合成是以mRNA分子为模板， 在 反转录酶的作用下，利用适当引物引导DNA的 合 成过程。
4、黏性末端片段与载体的连接
为了使cDNA双链分子较方便地克隆入相应的载体， 常在oligo(dT)寡聚引物一端链接上含有特定限制 性内切核酸酶黏性末端的接头分子。
5、离体包装获得重组噬菌体
1、运用氨基酸序列信息进行 cDNA筛选2、运用标记抗体进行cDNAcDNA插入的位置位于载体上的一 段表达的基因中，插入的cDNA有可能被翻译出 蛋白，因此还可以采用适当的标记抗体进行筛 选。同样，运用样本池进行分级式的PCR扩增筛 选也适用于cDNA的筛选。
在细胞表达的各种mRNA尽管具体序列不同，但基 本上都是由3部分组成，即5'端非翻译区，中间的 编码区和3'端非翻译区。非翻译区的序列特征对 基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是 合成基因产物-蛋白质的模板。因此，要保证cDNA 序列的完整性。
Your TopNA为材料，特别克隆对应于一种mRNA序列，这样在目
的基因选择中出现假阳性的概率就会比较低。 4、cDNA克隆可进行原核表达。
Your Topic的最大好处是可以将 重组分子包装成病毒颗粒，然后感染大肠杆菌， 高效的将重组分子导入到细菌中增殖。

菰均一化全长cDNA 文库的构建

菰均一化全长cDNA 文库的构建

菰均一化全长cDNA 文库的构建作者：臧剑颜育民张志刚邹世湘彭琼来源：《湖南农业科学》2017年第04期摘要：为了获得国家二级保护植物品种菰的功能基因信息，并克隆功能基因片段，研究以SMART（switching mechanism at 5 end of RNA transcript）方式合成菰全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建菰叶片组织的均一化全长cDNA文库。

该cDNA文库库容量大，达到了3.6×106 PFU/mL，插入片段平均长度为1 000 bp，重组率为97.9%。

均一化全长cDNA文库能有效富集低丰度表达基因，降低冗余率，适用于目的基因的筛选，以及后续的基因、蛋白互作分析。

关键词：菰；均一化；cDNA文库；功能基因中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2017）04-0011-03Establishment of a Normalized Full-Length cDNA Library of Zizania latifoliaZANG Jian1，YAN Yu-min2，ZHANG Zhi-gang2，ZOU Shi-xiang3，PENG Qiong4（1. Guangdong Gudao Agricultural Limited Company， Guangzhou 511400， PRC； 2. Hunan Hybrid Rice Research Center，Changsha 410125， PRC； 3. Hunan Wangxianglong Agricultural Limited Company，Changsha 410125， PRC；4. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center， Changsha 410125， PRC）Abstract：In order to obtain functional genes， a narmalized stems cDNA library was constructed from precious plant Zizania latifolia （Griseb.） Stapf. SMART （switching mechanism at 5 end of RNA transcript） cDNA synthesis combined with DSN （duplex-specific， nuclease）normalization was applied to construct the normalized full-length cDNA library of Z. latifolia. The titer of cDNA library was about 3.6×106 PFU/mL and the average insertion size was about 1.0 kb with high recombination rate （97.9%）. Homogenization full-length cDNA library enrichment of low abundance is suitable for the purpose of gene selection and subsequent analysis of the gene and protein interactions， for expressing genes effectively and reducing the redundancy rate.Key words：Zizania latifolia； normalization； cDNA library； functional gene菰（Zizania latifolia （Griseb.） Stapf）即茭白，为多年水生禾本科植物，国家二级保护植物品种，也是水稻的近缘属。

cdna文库

cdna文库

CDNA文库什么是CDNA文库？CDNA文库（Complementary DNA Library）是由转录过程中产生的mRNA反转录合成的cDNA构建而成的一系列DNA片段的集合。

CDNA文库可以用于许多生物学研究领域，包括基因表达分析、基因克隆和功能研究等。

cDNA文库的建立过程1. 提取RNA在构建CDNA文库之前，首先需要从目标生物（比如细胞、组织或细菌）中提取总RNA。

RNA提取方法根据目标生物的类型和样本的特点会有所不同，常见的RNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。

2. 反转录合成cDNA提取到的总RNA包含了多种mRNA，而mRNA中所含的信息即为我们所关注的基因表达信息。

为了将mRNA转化为cDNA，在反转录反应中需要使用逆转录酶（reverse transcriptase）以RNA作为模板合成相应的单链cDNA。

反转录酶能够将RNA中的核苷酸逆向合成cDNA，同时还需要引物，通常使用随机引物（random primer）或寡聚dT引物（oligo(dT) primer）。

3. 第二链合成合成的cDNA为单链结构，需要通过第二链合成（second strand synthesis）制备出双链cDNA。

第二链合成的方法一般采用DNA聚合酶（DNA polymerase）和RNase H（用于降解RNA模板）的组合反应。

4. 文库构建构建CDNA文库的关键步骤是将合成的双链cDNA插入载体DNA中。

载体DNA通常选择质粒（plasmid）或噬菌体（bacteriophage）等。

具体步骤如下：•首先，双链cDNA需要通过限制酶切（restriction enzyme digestion）将其切割成适当大小的片段。

•然后，准备好的载体DNA也需要通过相同的限制酶切进行处理。

•接下来，将切割后的cDNA片段与处理好的载体DNA进行连接，使用DNA连接酶（DNA ligase）进行连接。

利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库

利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库陈华;姜宝杰;张冲;曾建斌;邓烨;庄伟建【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)011【摘要】SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行.经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106 cfu·mL-1,重组率达93.3％,全长率为59％.插入片段大小多在1.0～2.0 kb,所占比例为70％,平均大小在1.1 kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu·mL-1,可用于长期保存.【总页数】5页(P1178-1182)【作者】陈华;姜宝杰;张冲;曾建斌;邓烨;庄伟建【作者单位】福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S565.2【相关文献】1.利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库 [J], 蔡铁城;曾建斌;陈顺辉;陈华;贺小彦;张冲;庄伟建2.利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库 [J], 韩瑜;强维亚3.利用改进的Oligo-capping法构建手掌参全长cDNA文库 [J], 周建平;杨足君;白丽莉;冯娟;李光蓉;邓科君;任正隆4.利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库 [J], 郭晋隆;阙友雄;刘金仙;郑益凤;陈如凯;许莉萍5.利用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草(Ae.speltoides Tausch)全长cDNA文库 [J], 毛新国;孔秀英;赵光耀;贾继增因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定以《烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定》为标题，近年来以CDNA技术为主要研究技术的生物识别领域发展迅速，烟草，作为世界上最常见的特殊作物，是基因工程实验的重要模式植物。

因此，烟草优质品种的花全长cdna文库构建和质量鉴定是非常重要的。

本文基于现有技术和数据，综述了烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定的原理、方法和实践。

由于烟草作物具有特殊的结构和分子特性，烟草花蕊组织是花全长cdna文库构建的主要材料，其具有高等生命特性。

因此，构建烟草优质品种花全长cdna文库的技术原理主要有以下四点：（1）采集和筛选烟草花蕊组织;（2）烟草花蕊组织的破裂、抽提、纯化和检测;（3）烟草花蕊组织cdna的文库构建;（4）文库的质量检测和鉴定。

在烟草优质品种花全长cdna文库的构建方法中，采用烟草花蕊抽提cdna的方法来构建文库，这是一种新型的cdna文库构建方法。

该方法可以有效提高文库构建的效率，避免无效cdna的异常累积。

在质量鉴定方面，主要通过计算文库深度和宽度，鉴定全长文库的覆盖率，检测文库中的cDNA来进行鉴定，以保证烟草优质品种花全长cdna文库的质量。

目前，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定技术已取得了较好的效果，成功构建了大量的花全长cdna文库，将用于今后烟草基因工程实验等研究。

然而，在构建和质量鉴定过程中，仍然存在着不少问题，比如文库构建效率低、文库覆盖率不足等，需要进一步改进和完善技术流程，以提高文库构建效率和质量鉴定的准确性。

综上所述，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定是烟草基因工程实验的重要前提，也是进行后续研究的基础。

未来，研究者将开展更多的实验研究以改善文库构建和质量鉴定技术，更深入地研究烟草基因工程实验。

cDNA文库构建实验服务

cDNA文库构建实验服务实验技术服务：cDNA文库的构建是功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，它为基因克隆、芯片制备、功能基因筛选等研究打下重要基础。

晶莱生物采用SMART实验策略实现cDNA文库的构建,服务涉及RNA抽提、mRNA纯化、RT-PCR、同源重组、转化、文库评价等。

【晶莱生物】技术原理及背景：常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。

由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。

在做表达文库时，如果cDNA的两端是同一个酶切位点，由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体，反向接入载体的那些cDNA 不能正确表达，因而有50%的可能丢失。

然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题，影响产率。

另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。

虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。

利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连接。

这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。

SfiI是一个在真核生物中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。

SfiI识别序列为GGCCNNNN^NGGCC，中间的5个碱基为任意序列。

因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。

这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。

cDNA文库及其构建.

cDNA文库科技名词定义中文名称：cDNA文库英文名称：cDNA library定义：含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。

应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

概述cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA （cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA 克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。

cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。

但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA 文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。

高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

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自 ２０ 世 纪 ７０ 年 代 中 期 首 例 ｃＤＮＡ 克 隆 问 世 以 来 ， 已 经 发 展 了 许多 旨 在 提 高 ｃＤＮＡ 合 成 效 率 和 长 度 的 方 法 ， 并 对载管该系统在载体的设计方面 非常成熟， 然而， 该系统构建过 价 值 。 传 统 ｃＤＮＡ 文 库 构 建 方 法 由 于 反 转 录 能 力 差 ， ｃＤＮＡ 内切酶位点保护不彻经不能适 应 目 前 大 规 模 、高 通 量 、高 效 的 功 能 基 因 组 研 究 需 要 。因 此 ， 寻找一种此， 笔者以人胎盘组织为材 料， 研究了一种以 ＬＤ!ＰＣＲ 为基础的简人胎盘组织， ＪＧ４５ 质粒和 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 菌株， 由 西北农林科技大学动物科技学院实验室保存； Ｍ!ＭＬＶ 反转 录酶， ＳｆｉⅠ限制性内切酶， Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶， Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ 及 ＤＥＰＣ， 购自大连宝生物公司； 质粒小量快速提取试剂盒， ＰＣＲ 产 物 纯 化 试 剂 盒 ， 购 自 Ｂｉｏ!Ｄｅｖ 公 司 ； Ｔｒｉｚｏｌ， 购 自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ； 引物 合 成 和 测 序 ， 由 上 海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生 物 公 司公司完成； 其余试剂均为国产分析纯。引物序列为：
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒ ａｒ ｙ Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ＬＩＵ Ｈｏｎｇ!ｊｕｎ ｅｔ ａｌ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆．Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＴ!ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ Ｍ!ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｔｈｅｎ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ （ｄｓ!ｃＤＮＡ） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＳｆｉⅠ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＬＤ!ＰＣＲ （Ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ） ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＪＧ４５ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｓｆｉ Ｉ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅｎ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ７．０１×１０５ ｃｌｏｎｅｓ ｐｅｒ μｇ ｄｓ!ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ９６％． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ８０ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ， ｎｏ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ． ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ； Ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ； Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕ分别为 和 ５．７３×１０μｇ ｄｓ&# ＤＮＡ， 通过酶切鉴定 ｃＤ ｋｂ， 在 １００ 个随机提取的质粒 中 仅图见图 ３。
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００７， ３５（ ５） ： １３０５－ １３０６， １３１６
责任编辑 姜 丽 责任校对，２ ＊， 吴淑云 １， 韩增胜 １， 刘智华 １， 李文烨 １
（ １．西北农林科技大学动物科技学院， 陕西杨凌 ７１２１００； ２．燕山大学 环境与化学工程学院生物工程系， 河北秦皇岛 ０６６００４）
Ｆ１： ５’ !ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣ ＧＧＣＣＧＧＧ!３’
Ｒ２： ５’!ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ !ｄ（ Ｔ）
基金项目 作者简介 收稿日期
河北省秦皇岛科技局转基因动物生产基因工程药物研究项
目（ Ｄ０８） 。 刘 红军（ １９７４－ ） ， 男， 河南 汝州 人， 硕 士研 究生， 研 究方 向： 动 物生殖生理与调控技术。＊ 通讯作者， 教授， 博士生导师。 ２００６! ０９! １４
ＰＣＲ 程序设置： ９５ ℃预变性 １ ｍｉｎ； ９５ ℃变性 １５ ｓ， ６８ ℃ 复性 １ ｍｉｎ， ６８ ℃延伸 ６ ｍｉｎ， 进行 ２０ 个循环； ４ ℃保温 ３０ ｍｉｎ。 扩增产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳鉴定合成的 ｄｓ! ｃＤＮＡ 的大小。 １．２．４ ＰＣＲ 产物的纯化。取 ５０ μｌ ＬＤ!ＰＣＲ 产物， 加入 ２ μｌ 蛋白酶 Ｋ （ 浓度为 ２０ μｇ／μｌ） ， 瞬时离心混匀， ４５ ℃孵育 ２０
３０Ｎ!１Ｎ!３’ Ｆ３： ５’!ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ!３’ Ｒ４： ５’!ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡ!３’
１．２ 方法 １．２．１ 胎盘组织总 ＲＮＡ 的提取。称取 １００ ｍｇ 胎盘组 织 放 入预冷的匀浆器中， 加入 １ ｍｌ ｔｒｉｚｏｌ， 匀浆后， 室温放置 １０ ｍｉｎ， ４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、离心 １０ ｍｉｎ， 取上清 液 至 新 管 并加 入 ２００ μｌ 氯仿抽提 ２ 次。取抽提后的无机相用等体积的异丙醇沉 淀 ， 用 浓 度 为 ７０ ％的 乙 醇 漂 洗 沉 淀 ， 稍 晾 干 后 用 ＤＥＰＣ 处 理 ｄｄＨ２Ｏ 溶解沉淀。用蛋白核酸测定仪测定总 ＲＮＡ 的浓度 和纯度， 以浓度为 １．０ ％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量。 １．２．２ ｃＤＮＡ 第 １ 链的合成。以 ２ μｇ 总 ＲＮＡ 为模板， 引物 Ｆ１、Ｒ２ 各 ２ μｌ， ＤＥＰＣ 处理 ｄｄＨ２Ｏ 补充 至 １０ μｌ， ７０ ℃变 性 １０ ｍｉｎ 后 立 即 冰 上 冷 却 ２ ｍｉｎ， 得 到 引 物／模 板 混 合 物 。 在 Ｍ!ＭＬＶ 逆转录酶的作用下， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。反应体系 为： １０ μｌ 上述混合物， ５×Ｍ!ＭＬＶ 缓冲液 ４ μｌ， ｄＮＴＰ．ｍｉｘ （ 浓 度 为 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ） １ μｌ， ＲＮａｓｅ 抑 制 剂 ０．５ μｌ， Ｍ!ＭＬＶ １ μｌ， ＤＥＰＣ 水补至 ２０ μｌ。４２ ℃温育 １ ｈ， 然后 ７５ ℃温育 １５ ｍｉｎ， 冰上冷却 ３ ｍｉｎ， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。 １．２．３ ｃＤＮＡ 第 ２ 链 的 合 成 。ＰＣＲ 反 应 体 系 ： ５ μｌ１０×缓 冲 液， ｄＮＴＰ ８ μｌ， Ｆ３、Ｒ４ 引物各 ８ μｌ， ＭｇＣｌ２ ４ μｌ， ＤＮＡ 聚合酶 １ μｌ， ｃＤＮＡ 样品 ２ μｌ， ｄｄＨ２Ｏ ２８ μｌ。
摘要 建立了一 ＲＮＡ， 利用引物 Ｆ１、Ｒ２ 在逆转录酶 Ｍ!ＭＬＶ 的作用下合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用引物 Ｆ３、Ｒ４ 在 ＤＮＡ 聚合酶的作用下通过 ＬＤ!ＰＣＲ 方法合成 ｃＤＮＡ 第 ２ 链； 双链 ｃＤＮＡ 经 ＳｆｉⅠ酶切， 通过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接到经相同酶切的行了分析。!ｃＤＮＡ， 重组率为 ９６ ％； 对随机提取的 １００ 个克隆质粒 的插入序列进行分析， 共获得 ８０ 个不同的 ｃＤＮＡ 序列， 且符合要求， 可用于大规分类号 Ｑ５０１ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００７）７ 年
ｍｉｎ， 用 ｄｄＨ２Ｏ 补至 １００ μｌ， 等体积酚／氯仿抽提， 无水乙醇沉 淀 ， 沉 淀 溶 解 于 适 量 的 ｄｄＨ２Ｏ 中 ， 并 用 Ａ２６０／ Ａ２８０ 计 算 ｄｓ" ｃＤＮＡ 的浓度， 调整其终浓度为 ０．;ｃＤＮＡ， 按 ｃＤＮＡ 与载 体 摩 尔 比 为 ３∶１ 加 入 经 同样 酶 切 的 质 粒 载 体 ＪＧ４５， 在 ２０ μｌ 连接 体 系 中 加 入 １ μｌＴ４ＤＮＡ 连 接 酶 和 １０×Ｔ４ＤＮＡ 连 接酶缓冲液 ２ μｌ， １６ ℃过夜。取连接液 ５ μｌ， 用电转化法导 入 到 受 体 菌 ＪＭ１０９ 中 ， 取 １、１０ 和 １００ μｌ 转 化 液 按 １０－ ３、 １０－ ２、１０－１ 稀释后， 取 ２００ μｌ 涂布于含有 １００ μｇ／μｌ 氨 苄 青 霉 素 的 ＬＢ 固 体 平 板 上 ， ３７ ℃培 养 １２ ｈ， 统 计 菌 落 数 ； 剩 余 的 转化产物加到 ２ ｍｌ ＬＢ 液体培养基中， ３７ ℃过夜培养， 加提取 试 剂 盒 提 取 质 粒 ＤＮＡ， 经 ＳｆｉⅠ酶 切 ， 并 在 浓 度 为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳中鉴定插入 ｃＤＮＡ 片段的大小。 １．２．６ 重组克隆的测序及同源性分析。对随机挑选的质粒 ＤＮＡ 进行测序， 测序工作由上海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生物公司完成。 ２ 结果与分析 ２．１ 胎盘 组 织 总 ＲＮＡ 的 提 取 采 用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂 氯 仿 提 取 获 得 胎 盘 组 织 的 总 ＲＮＡ， 经 蛋 白 核 酸 测 定 仪 分 析 表 明 ， Ａ２６０／Ａ２８０ 为 １．９８， 浓度为 ４８８ ｎｇ／μｌ。用浓度为 １．０ ％甲醛变性 琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量， 结果 ２８、１８ Ｓ 条带清晰， 亮度约为 ２∶１（ 图 １） ， 说明提取的总 Ｒ取 ２ μｇ 胎盘组织总 ＲＮＡ 逆转录合 成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用 ＬＤ"ＰＣＲ 获得 ｄｓ"ＤＮＡ， 取 １０ μｌ ＰＣＲ 产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳检测， 结果产物 均匀分布在 ０．５～３．０ ｋｂ（ 图 ２） 。