构建全长cDNA文库

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。

但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

构建全长cDNA文库时应当注意事项构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。

但都应当注意以下四个方面：一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。

虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。

至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。

如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。

这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。

反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。

反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。

少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。

Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。

滇紫草培养细胞全长cDNA文库的构建、基因序列及表达分析的开题报告一、研究背景和意义滇紫草（Lithospermum erythrorhizon）是一种广泛分布于我国西南地区的药用植物，其根部可提取出红根素等具有重要药理活性的天然产物。

近年来，由于其丰富的生物活性及广泛应用价值，滇紫草的研究引起了广泛关注，研究重点主要集中在其生物合成及调控机制、基因组学和代谢组学等方面。

全长cDNA文库是一种重要的基因组学研究工具，可以全面反映物种的基因表达情况和基因组结构特点，为分子生物学研究提供了一个有力的手段。

目前，关于滇紫草的全长cDNA文库构建和基因表达分析研究还较为缺乏。

因此，本研究拟从滇紫草中筛选出一批与其生长发育、次生代谢等相关的差异表达基因，构建滇紫草全长cDNA 文库，并利用生物信息学手段进行基因序列分析和表达规律的研究，为深入探讨滇紫草生物合成与代谢调控机制等方面奠定基础。

二、研究内容和步骤（一）构建滇紫草全长cDNA文库1. 提取滇紫草总RNA，并采用Oligo(dT)选育法获得poly(A) mRNA；2. 将poly(A) mRNA反转录为cDNA，加入适量的Adaptor连接器，通过PCR扩增得到cDNA片段；3. 将cDNA片段插入载体pEASY-T1，并将其转化入大肠杆菌DH5α中，进一步筛选获得滇紫草全长cDNA文库。

（二）基因序列分析1. 对所获得的滇紫草全长cDNA文库进行测序；2. 利用生物信息学方法，对所得序列进行拼接和比对分析；3. 针对部分关键基因，进行进一步的序列结构和结果预测分析。

（三）基因表达规律的研究1. 利用实时荧光定量PCR技术，研究滇紫草不同组织和生长期的基因表达规律；2. 结合全长cDNA文库测序结果和基因表达实验数据，以及生物统计学方法，筛选出滇紫草关键基因并对其进行功能分析。

三、预期研究成果1. 成功构建滇紫草全长cDNA文库，并获得大量高质量的cDNA序列信息；2. 对部分基因进行序列结构和结果预测分析，揭示其生物学功能；3. 通过实时荧光定量PCR技术，获得滇紫草不同组织和生长期的基因表达规律，并筛选出关键基因；4. 对滇紫草的生物合成和代谢调控机制等方面进行深入研究，为其开发和利用提供基础和参考。

全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。

但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。