pYC2-NT C酵母表达载体说明

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pYC2/NT C编号载体名称北京华越洋生物VECT2840 pYC2/NT C载体基本信息出品公司: Invitrogen载体名称: pYC2/NT C质粒类型: 酿酒酵母表达载体；营养缺陷型筛选载体克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶启动子: GAL1载体大小: 4701 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: His t ag（N-‐端）, X press E pitope(N-‐端)； V5 E pitope T ag(C-‐端）, H is T ag (C-‐端）载体抗性: Ampicillin真核筛选标记: URA3克隆菌株: DH5α、TOP10、JM109 表达菌株: INVSc1备注: pYC2/NT A,B,C载体之间仅读码框不同，相互间相差一个碱基对；pYC2/NT 载体是营养缺陷型筛选载体。

产品目录号: -‐-‐组成型/诱导型: 组成型载体质粒图谱和多克隆位点信息载体序列ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCG TCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGA TTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAAC CTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTAT TTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAA ACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGT AATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC CCGGATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTTACCATGGGG GGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGA TCTGTACGACGATGACGATAAGGTACCCGGATCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCAC AGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGT CTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCCTAGAG GGCCGCATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACC GAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAG TATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGT AACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGC TGCGGCCCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTT CCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACT CAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAA AGGCCAGCAAAAGCCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCC CCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAA AGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACC GGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTA TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCG ACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCA CTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCT TGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAG CCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG TGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTG ATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG ATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAA AGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC GATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGG AGCGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGAT TTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGC GCAACGTTGTTGGCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACTCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTC AGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAG CTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGG CAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTAC TCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACG GGATAATAGTGTATCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGG CGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATG CCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATG GGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTAATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTT ATAATACAGTTTTTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGCCTGCTTTTCTG TAACGTTCACCCTCTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAAATAGTCCTCTTCCAACAATAATAAT GTCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTCTATACTGTTGACCCAATGCGTCTCCCTTGT CATCTAAACCCACACCGGGTGTCATAATCAACCAATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATGTCT CTTTGAGCAATAAAGCCGATAACAAAATCTTTGTCGCTCTTCGCAATGTCAACAGTACCCTTAGT ATATTCTCCAGTAGATAGGGAGCCCTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAGGTT CCTTTGTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGGCCCACCACACCGTGTG CATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCTGTATACACCCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTA TTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCTTCGAAGAGTAAAAAATTGTACTTGGCGGATAATGCCT TTAGCGGCTTAACTGTGCCCTCCATGGAAAAATCAGTCAAGATATCCACATGTGTTTTTAGTAAA CAAATTTTGGGACCTAATGCTTCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACATCCAATGA AGCACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAAATAGCTTGGCAGCAACAGGACTAGGA TGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTCGACATGATTTATCTTCGTTTCCTGCAGGTTTT TGTTCTGTGCAGTTGGGTTAAGAATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTA TATATACCAATCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATCA AAAAAATTTCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGATGAATTGAATTGA AAAGCTAGCTTATCGATGGGTCCTTTTCATCACGTGCTATAAAAATAATTATAATTTAAATTTT TTAATATAAATATATAAATTAAAAATAGAAAGTAAAAAAAGAAATTAAAGAAAAAATAGTTTT TGTTTTCCGAAGATGTAAAAGACTCTAGGGGGATCGCCAACAAATACTACCTTTTATCTTGCTCT TCCTGCTCTCAGGTATTAATGCCGAATTGTTTCATCTTGTCTGTGTAGAAGACCACACACGAAAA TCCTGTGATTTTACATTTTACTTATCGTTAATCGAATGTATATCTATTTAATCTGCTTTTCTTGT CTAATAAATATATATGTAAAGTACGCTTTTTGTTGAAATTTTTTAAACCTTTGTTTATTTTTTT TTCTTCATTCCGTAACTCTTCTACCTTCTTTATTTACTTTCTAAAATCCAAATACAAAACATAAA AATAAATAAACACAGAGTAAATTCCCAAATTATTCCATCATTAAAAGATACGAGGCGCGTGTAA GTTACAGGCAAGCGATCCGTCCGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGG AGCGGGGGCTAGGGCGGTGGGAAGTGTAGGGGTCACGCTGGGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC TTAATGGGGCGCTACAGGGCGCGTGGGGATGATCCACTAGT其他酵母表达载体：p416GFD pPIC9p53blue pPIC9KpACT2-‐AD pPIC9k-‐HispAD-‐GAL4-‐2.1 pPICZApADH2 pPICZBpAUR123 pPICZCpBridge pPICZαApCL1 pPICZαBpDEST32 pPICZαCpDisplay pPICZαDpDR195 pPICZαFCpESC-‐His pPICZαGBpESC-‐Leu pPink-‐HCpESC-‐TRP pPink-‐LCpESC-‐URA pPinkα-‐HCpFA6a-‐FGP(S65T)-‐kanMX6 pRS316pFLD pRS403pFLD/CAT pRS405pFLDα pRS406pGADT7-‐T pRS414pGAG424 pRS415pGAPZA pRS416pGAPZB pRS41HpGAPZαB pRS426pGAPZαC pRS426galpGBKT7 pSEP1pGBKT7-‐53 pSEP2pGBKT7-‐Lam pSEP3pHIC-‐PI pSospHIL-‐D2 pSos-‐MAFBpHIL-‐S1 pUG66pHis2 pYC2/CTpHisSi-‐1 pYC2/NTApMETA pYC2/NTBpMETB pYCP211pMETC pYEPlac112pMETαA pYEPlac195pMETαB pYES2pMETαC pYES2-‐EGFPpMyr pYES2-‐kanpPIC3.5 pYES2-‐NTApPIC3.5K pYES2-‐NTBpPIC6B pYES2-‐NTCpPIC6C pYES3/CTpPIC6αA pYES6/CTpPIC6αB pYES-‐DEST52pPIC6αC pYIP211pYX212 pYIP5SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-‐EGFP Ycplac33。

多形汉逊酵母外源基因表达系统

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多形汉逊酵母外源基因表达系统
$ 陈凤菊!，卢善发!" 胡敦孝$
［"］时也发现类似现象。
分泌两种。分泌型表达载体除含有上述部件外，还含分泌信号序列。对于 6$7、牛溶血酶和转化酶基因等，其自身的信号肽序列就足以引导在甲醇酵母中表达，对于自身没有信号序列或自身的信号肽序列不能在酵母中起作用的蛋白基因，则需将此基因与酿酒酵母 ! （ <= 、西方许旺酵 8交配因子 !!）母（ >:?@.778ABC:+; A::81+7/.*8; ）葡萄糖淀粉酶 D!<! 基因、三高血糖激素基因、黑色曲霉（ !;0+E8*F 叶真蟹（ 6.-:87,; B.+7.; ）（ G*,CH+-ABC:+; *.:/8; ）杀伤 *,; 78E+- ） D!< 基因或乳克鲁维酵母
"期
陈凤菊等：多形汉逊酵母外源基因表达系统
(#=
用来调控外源基因的表达。它们受甲醇的强诱导，受葡萄糖和乙醇阻遏，但在低浓度甘油或葡萄糖中可解阻遏。由于有基因相似的调控机制，巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶（ !"#!）
［!"， !#］启动子，也可以用来调控多形汉逊酵母中基因的表达。
或双交换与染色体上的同源位点发生重组，定点整合到染色体的同源位点。线性化质粒发生同源整合的频率仅为 !C 这可能是因为在多形汉逊酵母中存在着双链缺口 D ((C ，（:7F）修复系统，它能以非同源重组的方式使线性质粒重新环化，从而使质粒能够进行复制。这种修复系统的准确率可达 ’?C D @*C［!=］。 !"# 高拷贝转化子的筛选多数蛋白质的表达存在基因剂量效应，筛选高拷贝数的

LentiCRISPRV2载体使用说明

LentiCRISPRV2载体使用说明
一载体简要说明
1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。

3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

二 gDNA设计说明
对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释
退火
50ul 体系
引物 20ul（上下游各 10ul）、
水 25ul、
NEB buffer 2（10*）5ul 95℃，5min。

然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。

LentiCRISPR V2 载体酶切
200ul体系：
BsmBI 2ul；
10*buffer 20ul；
质粒 10ul（2ug）
水 16ul 55℃，酶切 2 小时胶回收
连接
2*solutionI 5ul
退火引物 4.5ul
线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜，转化挑菌送测序。

毕赤酵母表达系统资料整理

Mut+ 和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一A0X1及A0X2细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

在YPD酵母膏、蛋白豚、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h ° Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115 > X- 33、KM71 和SMD1168 的区另I]GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。

GS115 > KM 71 ' SMD1168在组氨酸脫氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。

GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts （载体取代AX01基因），可以在MM和MD培养基上鉴定表型。

毕赤酵母表达知识

毕赤酵母表达知识很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

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