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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
pDR195编号 载体名称北京华越洋生物VECT2970 pDR195载体基本信息出品公司: Addgene载体名称: pDR195质粒类型: 酵母菌表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: PMA1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6318bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: Ampicillin筛选标记: URA3备注: -‐-‐产品目录号: 36028稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 非病毒载体质粒图谱和多克隆位点信息载体序列ORIGIN1 cccagcctcg agcggccgcg cggatccagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa 61 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa 121 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt 181 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga 241 ctcttaggtt ttaaaacgar aattcttatt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt 301 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccaat 361 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 421 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 481 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 541 cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataatcggat cgtacttgtt acccatcatt 601 gaattttgaa catccgaacc 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pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3pHIC-PI pSospHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-EGFP Ycplac33。
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
一、菌种1.大肠杆菌一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10）2.毕赤酵母菌.GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。
培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。
KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。
培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。
SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。
二、毕赤酵母菌分泌表达载体诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉素筛选外源基因多拷贝转化子。
（无标签）pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。
三、实验试剂限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基，酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。
四、实验简要计划用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。
所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。
通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。
将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基中培养，提取质粒进行酶切及PCR鉴定正确后，送去测序。
弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定谢荣华;吴翔;舒衡平;蒋立平;范久波;谭逵;张琼【期刊名称】《中国病原生物学杂志》【年(卷),期】2007(2)2【摘要】目的构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础。
方法PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。
结果特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框。
结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒。
【总页数】3页(P115-117)【关键词】刚地弓形虫;GRA1;酵母表达质粒;构建;鉴定【作者】谢荣华;吴翔;舒衡平;蒋立平;范久波;谭逵;张琼【作者单位】中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室【正文语种】中文【中图分类】R382.5【相关文献】1.弓形虫GRA 3基因真核表达质粒的构建与鉴定 [J], 薛书江;张守发;栾杨2.弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定 [J], 陈镭;李成朋;陈弟;赵徐寒晖;蒋凯;林佳鑫;刘阳阳;胡昕;谭峰3.弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2的构建与鉴定 [J], 吴翔;汪世平;舒衡平;谭逵;张琼4.弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定 [J], 王丹静;舒衡平;蔡力汀;吴翔;蒋立平5.VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定 [J], 王娜;刘彦双;刘宁;金超;张喜路;金月;薛书江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒三叶虫(2007-4-25 13:59:55) 点击:75 回复:0 IP:60.216.104.*制作者：陈苗商汉桥毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3 等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
酵母蛋白表达案例1.实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过酵母表达体系获得目的蛋白A。
2.实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体ppic9k，利用Sac I线性化重组质粒ppic9k-A；（3）电转化毕赤酵母GS115进行蛋白表达，通过Western Blot检测蛋白A是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。
3.蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=29.07kd，pI=5.72（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：****(3) 蛋白性质分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。
结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体ppic9k上，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白C端添加His标签便于纯化。
4.表达载体构建4.1ppic9k-A质粒酶切验证：4.2 ppic9k-A质粒测序验证：部分序列比对结果图4.3 ppic9k-A质粒线性化分析:酶切鉴定Marker: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000,2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 12000Line1: 酶切前质粒Line2: 酶切后质粒基因名称：A（OD260/OD280:1.82）酶切位点：EcoRI/NotI钟鼎特色载体ppic9k5.蛋白表达及纯化蛋白表达鉴定6.实验结论结合SDS-PAGE和WB结果可以看出，目标蛋白A得到表达，3L发酵液得到0.75mg左右蛋白。
毕赤酵母表达系统的构建1.确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。
（所需药品-高保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。
）2.对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。
（所需药品- SalI、StuI、SacI 【用于于GS115产生His+Mut+】；BglII【用于于GS115产生His+Muts】）酶切体系酶切体系50 μL目的DNA 10 μL酶切缓冲液 5 μL限制性内切酶 1 μL超纯水34μL37 ℃酶切 1～4小时。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。
3.将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品-连接试剂盒SolutionⅠ[宝生物]）载体DNA0.5µL目的片段DNA 4.5µL连接试剂盒SolutionⅠ 5 µL充分混匀，置于16 ℃连接4 h或4 ℃连接过夜。
4.转入DH5α扩繁质粒（所需药品- A mp；DH5α；CaCl2）将DNA目的片段和载体的连接产物与200µL感受态细胞混匀，冰浴30min。
45℃热击45-60s，冰浴3min后加入800μL LB 液体培养基37℃震荡培养1h。
（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul A mp 的LB平板上，选择A mp 抗性克隆（2）挑取10 个A mp 抗性转化子，接种含150ug/ul A mp 的培养基，37 度振荡培养过夜（3 ）提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。
（pPIC9k 测序时，用α-factor 引物及3’AOX1 测序引物。
将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul 溶液）4 在0.85ml 过夜培养菌液中加入0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。
在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70 度保存。
5 测序证实结构正确后，可准备转化DNA5.毕赤酵母电转化：细胞准备：毕赤酵母感受态制备：（1）取1 mL GS115过夜培养物(OD6006．0～10．0)转接于100 mL YPD液体培养基中28℃-3O℃、250—300 r／min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1．0～1．3)（2）取此菌1 mL分装到1．5 mL EP管中，4℃、10 000 g离心1 min，弃上清液，沉淀用无菌水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。
酵母表达系统使用心得第一篇：酵母表达系统使用心得Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia 酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲醇酵母部分优点：1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达；2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平；3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产；4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。
产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
