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酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件

酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件

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5
凝集素展示表达系统
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凝集素展示表达系统
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7
凝集素展示表达系统
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8
絮凝素展示表达系统
絮凝素Flo1p 是一种新兴的展示系统,它是酿酒酵母细 胞表面类似凝集素的细胞壁蛋白。 • 目前，已经形成了两种类型的絮凝素展示系统 ： • 一是GPI 系统 ；根据目的蛋白的特性和实验目的确定截去 Flo1p 肽段的长度,然后,目的蛋白的C 端融合到锚定序列 上。 • 二是利用Flo1p 的絮凝结构域的黏附能力创建一个表面展 示系统。
酿酒酵母表面展示表达系统及应 用
报告人：刘顺
2010.11.10
.
1
主要内容 1 概念
2
两种系统
3
应用
4
优缺点
.
2
一、概念
酿酒酵母表面展示表达系统： 一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，
即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融 合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制（糖基磷脂酰肌醇，GPI锚定）， 使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面，之后用葡聚 糖酶抽提细胞壁目的蛋白。
.
9
GPI 系统
.
10
絮凝结构域系统
Байду номын сангаас
.
11
应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：
淀粉分解酶、纤维素分解酶、脂酶 2、环境治理中展示表达金属蛋白 3、蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 4、可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 5、免疫学中的应用
.
13

酵母表达系统

酵母表达系统
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵

酵母表达系统

酵母表达系统

C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met 信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达

酵母表面展示技术.pptx

酵母表面展示技术.pptx
第3页/共12页
• 载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘 露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价 方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提； 另一类蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消 化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚 定区域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如 Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族 蛋白，外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于 细胞表面，这些蛋白是常用的酵母表面展示载 体蛋白。
第6页与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达 在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。 GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以 非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
第10页/共12页
• 酵母表面展示与酶技术 • 酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊
的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物 和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游 离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反 复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不 利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程 中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因 而增加了载体成本费和固定化操作费用。利用表面展示 技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面 就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶 不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外 表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多 优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使 用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额 外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。

酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件

酿酒酵母表面展示表达系统及应用PPT课件
•12
•2
二、两种系统
•
酿酒酵母细胞壁主要由外层的甘露糖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ白和内层的葡
聚糖骨架组成，两者通过共价健相连。外层甘露糖蛋白有
两种类型：
• 一种是通过非共价健与酵母细胞壁松散相连并能被ＳＤＳ 提取出来的低分子量蛋白；
• 一种是必须被葡聚糖酶酶解细胞壁的β-１，3-和β-１，６葡聚糖层后才能被ＳＤＳ抽提的高分子量蛋白，包括凝集 素、絮凝素、Sed1p、Cwp1p、 Cwp 2p和Tip1p、Tir1p 、Srp1p等。后者的结构中大多都含有GPI锚定区域
•11
问题和展望
优点 1、可克隆较大外源蛋白 2、对表达的外源蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键,并与葡
聚糖共价结合，耐SDS 抽提 3、酵母生产快,容易培养，展示蛋白能稳定地在子代细胞中表达 4、表达的蛋白可用荧光激活细胞分选仪(FACS) 进行灵敏而方便地检测
和筛选 缺点： 1、天然活性不够，表达的蛋白可能不完整 2、表达量也不够,而且酒精往往会抑制生长 3、多拷贝载体不稳定，整合载体则拷贝数低，表达的蛋白量少
• 其中分别由AGα1、AGa1／AGa2和Flo1表达异源蛋白的 凝集素和絮凝素酵母细胞展示表达系统应用较多。
•3
凝集素展示表达系统
α凝集素和ａ凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖 蛋白，它们在酿酒酵母的交配型α（ＭＡＴα ）和 交配型ａ（ＭＡＴａ）单倍体细胞之间介导细胞 与细胞的性粘附，使细胞融合形成双倍体 。
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GPI 系统
•9
絮凝结构域系统
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应用
近几年来，酿酒酵母细胞表面展示表达系统迅速发 展并在多个领域获得应用，展现出广阔的发展前景。 1、作为生物催化剂展示表达各种酶蛋白：

酵母表达系统

酵母表达系统
AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH

酿酒酵母表面展示表达系统及应用

酿酒酵母表面展示表达系统及应用
４ 能够展示表达 １ ０ 个凝集素蛋白， 更利于高效表达具有
。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定区域与细胞蛋白的 Ｃ 端共价相 ?
连， 为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。Ｇ Ｐ Ｉ 锚定蛋白的 Ｃ 端包含疏水多肽， 当细胞蛋白被合成， 前体蛋白通过 ? 羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上， 其余蛋白则 位于内质网的内腔中。在极短的时间内， 疏水序列在 Ｐ Ｉ 锚置换， 转酰氨基酶作用下 ω位点裂开并同时被 Ｇ 然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细 胞膜外。在蛋白水解酶作用下， 分泌信号序列被切除， Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ从细胞膜上释放以 Ｇ Ｐ Ｉ 锚定形式与 细胞蛋白被 Ｐ ?
２ ］ 葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外 ［ 。可在许多真 ［ ３ ］ 核生物的质膜蛋白中发现 Ｇ Ｐ Ｉ ， 其结构高度保守。酵
生物活性的复杂蛋白。
１ 酵母细胞表面展示表达系统构成
１ ． １ 载 体 一个成功的表达载体应满足 ４个条件： （ １ ） 具有信 号肽序列， 使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞 外； （ ２ ） 具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表 ３ ） 与外源蛋白融合后， 载体蛋白的定 面而不能脱落； （ 位特性和外源蛋白的生物活性不会改变； （ ４ ） 在宿主菌 株中能稳定存在， 不会被细胞壁膜之间和培养基中的
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ２ ） ： １ １ ６～ １ ２ ２
酿酒酵母表面展示表达系统及应用
郭 钦１ 张 伟２ 阮 晖１ 何国庆１ （ １浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ９ ２温州医学院 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
３ 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用

酵母表达系统

酵母表达系统
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N二羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)

酵母表达系统-PPT课件

酵母表达系统-PPT课件

2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚

酵母表达系统

酵母表达系统

•巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基 因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可 在细胞中高水平积累。 AOX1的启动子是一种可诱导的强启
动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为
受体细胞，可高效表达外源基因。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面 抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。 毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了 解还比较少，且发酵周期也比较长。
Selecting a Pichia Expression Vector
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
Selecting a Pichia Expression Vector
Pichia Cloning
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的方式：
1. 载体的3‘ AOX1区与基因组的
expression and can even lead to cell death. Other important facts: • Doubling time of log phase Mut+ or MutS Pichia in YPD is ~2 hours • Mut+and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol • Doubling time of log phase Mut+Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
AOX1基因的末端发生同源重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生同源重组
Gene Replacement at AOX1 in GS115

酵母表达系统

酵母表达系统
通过适应性进化实验研究酵母在 不同环境下的适应机制，了解生 物进化的过程。
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。

酵母及其应用ppt课件

酵母及其应用ppt课件
外膜：含磷脂代谢的酶 内膜和嵴：呼吸链组分，ATP合成酶、 琥珀酸脱氢酶等
。 膜间腔：腺苷酸激酶、磷酸腺苷酸激酶 嵴间腔：TCA循环的酶等
.
内质网
内质网 ： 是存在于细胞质中的、由膜构成的、 呈游离或广泛互相连续的囊泡状的结构 。
种类: 粗糙型内质网 （rough ER） 光滑型内质网（smooth ER）
.
线粒体
1.一种半自主的细胞器，呈球形或棒状, 0.31×0.5—3um，分散在细胞质中。 双层单 位膜包围的 细胞器；其中含脂类、蛋白质、 少量RNA和环状DNA。
2.其DNA可自主复制，不受核DNA控制。决定 线粒体的某些遗传性状。
3.生物氧化中心、能量转换的基地
.
线粒体的功能
▪ 构造
外膜、内膜、嵴、膜间腔、嵴间腔
调节渗透压
.
海藻糖
海藻糖由两分子的吡喃葡萄糖单体以α-1,1糖苷键连接 而成 主要应用： 1：食品方面：改善食品风味、抗氧化、保鲜、延长保 藏期等。 2：生物工程方面：酶保护剂、医药药品的保存等。 3：农业领域：抗旱、抗寒植物、 4：其他方面：化妆品（保湿）等
.
其他结构
质粒 2 um质粒是一个环状、周长2 um的6kb双链DNA分子。可用于研究基因 调控、染色体复制的理想系统，也可作为酵母菌转化的有效载体，并组 建基因工程菌。
生理功能： 起物质传递的作用，另外还有合成脂类和
脂蛋白，与出芽起始有关。
.
核糖体
位于游离的细胞质中或附着在内质网上。 化学组成：与细菌类似 结构：核糖体的沉降系数为80s，它由60s和40s的两个亚基组成
。功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链。
.
高尔基体 (高尔基复合体)

酵母表达系统与方法

酵母表达系统与方法
筛选标记：HIS4 启动子：AOXI 作为分泌型表达时，外源基因需要接上一段信号肽序列
一种常用的巴氏毕赤酵母表达载体结构图
甲醇营养型的两种酵母表达系统比较
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
1. 应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控； 2. 表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高密度发
1981年Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基 因在酿酒酵母中表达并获成功。
酵母表达系统的组成
◆宿主：酿酒酵母、裂殖酵母、乳酸克鲁维亚酵母、
巴氏毕赤酵母等。
◆质粒载体
1. 质粒类型: 自主复制型质粒（Yeast replicating plasmid, YRp） 着丝粒质粒（Yeast centromeric plasmid, YCp ） 附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp) (自主复制,拷贝数高,不稳定, 易丢失) 整合型载体(Yeast integrating plasmid,YIp) (稳定性好,拷贝数低) YAC载体（Yeast artificial chromosome, ）
1. 以分裂的方式繁殖 2. 裂殖酵母与哺乳动物有许多相似之处 3. 表达的产物具有天然的构象和活性 4. 高效表达载体: pTL2M (含有高效的hCMV启动子)
裂殖酵母表达系统的优点
尽管裂殖酵母作为外源基因表达系统的发展远远 落后于酿酒酵母和巴氏毕赤酵母，但随着载体的发展， 裂殖酵母不仅可以表达胞内蛋白，也能高效表达膜蛋 白和分泌蛋；特别是裂殖酵母表达系统可以使外源基 因的产物保持天然的特性。因此，裂殖酵母作为外源 基因表达系被认为是最有前途的。
◆裂殖酵母表达系统
Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母）

第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档

第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
• 幻灯片 24
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
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成功表达的外源蛋白实例：
人血清蛋白和白细胞介素1β
乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点：
可以高密度发酵； 不需要甲醇防爆装置； 工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
◆甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和炭源表 Nhomakorabea载体：整合体型载体
（Invitrogene公司已开发出多种巴氏毕赤酵母表达载体 如：pPIC9, pHIL-D2, pHIL-S1,pPICZA, pPICZB, pPICZC系列和 pPICZaA, pPICZaB, pPICZa系列适 合于胞内和分泌的表达载体）
2. 选择标记: A.营养缺陷型选择标记(亮氨酸合成酶基因leu2,色 氨酸合成酶基因tri1,尿氨酸合成酶基因ura3,组氨 酶合成酶基因his3)
B.显性选择标记(氨基酸糖甙类抗生素G418,氯酶素， 潮酶素)
3. 外源基因表达的相关元件:启动子(pgk1,AOX, LAC4)、终止子
分泌信号序列
酵母表达系统与方法
酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋 白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为 宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点， 如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、 营养需求简单等。
但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核 生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成 二硫键等；B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要 经过复杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白 很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。
主要酵母表达系统
◆酿酒酵母表达系统
Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母)
◆乳酸克鲁维亚酵母表达系统
Kluyveromyces lactis （乳酸克鲁维亚酵母）
◆甲醇营养型酵母表达系统
Candida bodinii Hansenula polymorph(多形汉逊酵母) Pschia methanolica Pichia pastoris(巴氏毕赤酵母)
1981年Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基 因在酿酒酵母中表达并获成功。
酵母表达系统的组成
◆宿主：酿酒酵母、裂殖酵母、乳酸克鲁维亚酵母、
巴氏毕赤酵母等。
◆质粒载体
1. 质粒类型: 自主复制型质粒（Yeast replicating plasmid, YRp） 着丝粒质粒（Yeast centromeric plasmid, YCp ） 附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp) (自主复制,拷贝数高,不稳定, 易丢失) 整合型载体(Yeast integrating plasmid,YIp) (稳定性好,拷贝数低) YAC载体（Yeast artificial chromosome, ）
◆裂殖酵母表达系统
Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母）
不同酵母表达系统的特点
◆ 酿酒酵母表达系统
表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1
成功表达的外源蛋白实例：
人重组干扰素
酿酒酵母表达系统的主要不足：
产生量（g/L） 2.3 0.8 2.5 1.0 1.7 12.0 3.0 1.3 10.0 4.0
文献 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]
甲醇营养型酵母表达系统的主要不足：
1. 甲醇不适于食品工业生产； 2. 易发生火灾。
◆ 裂殖酵母表达系统的特点
1. 以分裂的方式繁殖 2. 裂殖酵母与哺乳动物有许多相似之处 3. 表达的产物具有天然的构象和活性 4. 高效表达载体: pTL2M (含有高效的hCMV启动子)
裂殖酵母表达系统的优点
尽管裂殖酵母作为外源基因表达系统的发展远远 落后于酿酒酵母和巴氏毕赤酵母，但随着载体的发展， 裂殖酵母不仅可以表达胞内蛋白，也能高效表达膜蛋 白和分泌蛋；特别是裂殖酵母表达系统可以使外源基 因的产物保持天然的特性。因此，裂殖酵母作为外源 基因表达系被认为是最有前途的。
主要酵母表达系统特性比较
外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤
酵,产量高(培养基中干物质含量高达130 mg/L)； 3.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和分
离纯化； 4. 对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中； 5. 高效表达 (~12 g/L)。
表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生
外源蛋白质 转化酶 D-丙氨酸羧肽酶 α--淀粉酶 Kunitz 蛋白酶抑制剂(AbPP) 瞬时抗凝蛋白 (TAP) 破伤风毒素片段C 百日咳抗原PGP 人免疫缺陷病毒膜外糖蛋白 肿瘤坏死因子(TNF) 人转铁蛋白N端
自1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点， 发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母，因为 酿酒酵母在酿酒业和面包业使用有数千年的历史，被 认为是安全生物；此外，酵母是单细胞低等真核生物， 它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工 程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后 加工的功能，有适于真核生物基因产物正确折叠的细 胞内环境和糖链加工系统，还能分泌外源蛋白质到培 养液中，利于纯化，并可减轻宿主细胞的代谢负荷。 特别是由于酿酒酵母2μ质粒的发现和酵母转化技术的 突破,酿酒酵母基因工程表达系统因此而建立并应用。
筛选标记：HIS4 启动子：AOXI 作为分泌型表达时，外源基因需要接上一段信号肽序列
一种常用的巴氏毕赤酵母表达载体结构图
甲醇营养型的两种酵母表达系统比较
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
1. 应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控； 2. 表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高密度发
分泌能力低 不能使异源蛋白正确糖基化 所表达的蛋白质的C-末端被截短
◆乳酸克鲁维亚酵母表达系统
表达载体：整合体型载体。 附加体型载体：1.胞质线性双股DNA
杀伤质粒;2. 含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列;3. 稳定高拷贝数2 μ样pKD1和pKL1质粒。
启动子：LAC4。
乳糖作为唯一的能源和炭源。