植物细胞培养生物反应器研究进展

第１７卷第２期浙江：ｈ＂－Ｙ－学院学报！！！！篓！旦！！！塑！！！！三！墅！竺！些竺！墅丝！些！垒植物细胞的固定化培养王素芳（浙江万里学院。

宁波３１５１００）ｖ。

１．１７Ｎｏ．２Ａｐｒ２００４摘要；植物细胞培养己成为生产医药、食品、化妆品等重要化台物盯‘条新途径．在提高次级代谢物产龋的研究中，崮定化培养逐步硅示其优势文章重点介绍了崮定化培养的特点、固定化疗法、固定化反麻器和产物的释放四个方面的内容关键词：物细胞：固定化培养：固定化方法；产物释放；同定化反应器中田分类号：Ｑ８１３Ｉ“文献标识码：Ａ文章编号：１６７Ｉ－－２２５０（２００４）０２一００９６一０３收稿日期：２００３一ＩＩ－－０５作者镝介：于素芳，浙江万里学院生物与环境学院讲师．１９０２年．Ｈａｂｅｆｌａｎｄｔ在营养液中成功地培育了单个植物细胞，为植物细胞的培养翻开了新的一页．随厉，很多科学家对完善植物细胞培养技术展开了研究．１９７９年，Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ首次将高等植物细胞同定化培养以获得甘的次级代谢产物．此后，植物细胞的同定化培养得到不断的发展．逐步显示其优势．据币完全统计．约有５０多种植物细胞已成功地进行了固定化培养．１固定化培养的特点经过多年的研究发现，与悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点：（１）提高了次生物质的合成、积累；（２）能跃时间保持细胞活力：（３）可以反复使用；（４）抗剪切能力强；（５）耐受有毒前体的浓度高；（６）遗传性状较稳定；（７）后处理难度小等特点．在近几年的研究巾，不少学者又发现了固定化培养的新优点．１．１更好的光台作用一般情况下。

由于在固定化细胞团中形成了光密度梯度，内部的细胞有了较好的生长，所以固定化有助于植物细胞的光台作用Ｋｕｒａｔａ等培养用海藻钙凝胶固定阿拉伯咖啡细胞，发现生物碱产量与光密度的变化一致，而且细胞的生长小被高的光密度抑制．１．２促进或改变产物的释放在固定化培养中，产物和对细胞生Ｋ有抑制作用的代谢物可被培养基带走，这样，一方面有利于产物的生成，另一方１：５【『也防ｆ』：了已生成产物的进一步降解转化．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ．ＫｉｔａｋａｗａＮ等…实验证明烟草细胞的固定化促进了其产物酚醛塑料（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）的释放．而ＧｉｌｌｅｔＦ和ＲｏｉｓｉｎＣ等““发现包埋的烟草细胞（Ｎｉｅｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）和Ｓｏｌａｎｕｍａｖｉｃｕｌａｒｅ，能够将在悬浮培养时１ｉ释放的异东莨糟酵（Ｓｃｏｐｏｌｉｎ）释放到培养基中．２固定化方法２．１传统固定化方法包埋法是目前最普遍采用的固定化方法．特别是海藻胶包埋法，条件温和、价格便宜、方法简单，且特别适用于脆弱、敏感的植物细胞“’．吸附法ｉ乜是一种比较温和的同定化方法。

植物细胞培养一、定义●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。

●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然产物的主要来源。

●植物细胞培养具有以下优点：1、提高产率2、缩短周期3、提高产品质量4、易于管理，减轻劳动强度因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。

二、培养基常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基三、单细胞培养1、制备方法（1）机械法（机械磨碎、切割）（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）2、培养方法（1）平板法（似微生物平板培养）（2）看护培养与饲养层培养法看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。

饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。

（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。

（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。

①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。

②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。

③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。

④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。

3、保存（1）继代培养（高等植物、海藻等）（2）低温（ 5℃～10℃）（3）冷冻（ -20℃或液氮）植物细胞冷冻保存方法：在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。

植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（Plant transient expression system）是一种用植物作为生物反应器来表达外源基因的技术。

相对于传统的植物基因转化技术，植物瞬时表达系统具有操作简单、高效快速、适应性强等优点，因而在植物基因工程研究和产业化应用中得到了广泛应用。

近年来，植物瞬时表达系统在实验室中的应用日益增多，其研究进展也取得了很多重要的突破。

下面将就植物瞬时表达系统的研究进展进行详细的介绍。

一、植物瞬时表达系统的基本原理与方法植物瞬时表达系统是利用植物体内的洋结球病毒、冠状病毒等病毒载体，通过基因枪法、电穿孔法、冻融法等方法将外源基因或者载体转移到植物细胞中，然后通过植物细胞的生物机制来表达这些外源基因。

基本原理是：将目标基因的DNA序列插入病毒载体中，然后将这个病毒载体引入植物细胞，并利用植物细胞自身的转录和转译系统来表达目标基因。

植物细胞内的RNA聚合酶和核糖体可以识别和转录由病毒载体上的启动子引导的目标基因的RNA序列。

当前，植物瞬时表达系统主要包括两种方法：基因枪法（Gene gun method）和冷冻质子法（Cold protonema method）。

基因枪法是一种通过高速微粒束将外源基因转入植物组织或者细胞内的方法。

利用基因枪设备，通过调节高压氦气或者氮气，将导入的DNA颗粒射入目标组织。

该方法可以用于不同的植物组织、细胞和亚细胞的转化，适用性广泛。

而冷冻质子法则是利用电极直接将导入的DNA或RNA质子射向目标组织或细胞的方法。

冷冻质子法可以实现更高的转化效率，并可用于大规模的瞬时表达培养。

近年来，植物瞬时表达系统的研究进展迅速，主要体现在以下几个方面：1. 高效快速的基因转导技术：研究人员通过改进基因枪和冷冻质子等转导技术，提高了基因表达的效率和速度。

通过优化基因枪药剂的配方和冷冻质子的射击参数，可实现更高的表达效率。

2. 外源基因表达的调控：研究人员通过基因工程技术，构建了一系列的响应子集和调控元件，实现了对外源基因表达的调控。

植物组织培养和再生技术的研究和应用随着生命科学的迅猛发展，植物组织培养和再生技术已经成为现代植物学的重要分支之一。

该技术通过培养和再生植物组织，可以改良、选择、繁殖优良植物品种，提高农业生产效率和农产品的品质；同时，它还可以在生态环境保护、生物多样性保护等方面发挥重要的作用。

下面我将通过分析该技术的研究现状和应用情况，来探讨植物组织培养和再生技术的意义和前景。

一、植物组织培养和再生技术的研究现状植物组织培养和再生技术是一项复杂的生物技术，涉及植物生理学、细胞学、遗传学、微生物学等多学科知识。

它的研究过程包括植物组织的分离、培养基的配制、培养条件的控制和细胞分化、组织再生的观察等若干步骤。

在如此复杂的研究过程中，研究者们通过不断的尝试和改良，成功地培育出了一些应用广泛的植物组织培养和再生技术，如植物的组织培养和再生、植物的细胞培养、植物基因工程等。

这些技术不仅可以广泛应用于农业生产、林业、园艺和环境保护等领域，还被广泛地应用于基础科学研究中。

二、植物组织培养和再生技术的应用情况1、育种植物组织培养和再生技术可以为育种提供优良的植物材料。

通过组织培养和再生技术，可以对植物进行大量的无性繁殖，从而保持其优良基因；同时可以通过基因工程技术，对优良品种进行遗传改良，提高其产量和品质。

例如，美国的植物学家们利用组织培养和再生技术，通过对马铃薯进行基因改良，成功地将一些抗病的基因转移到马铃薯中，使其对病毒的抗性得到了提高，大幅度地增加了马铃薯的产量。

2、研究植物基因植物组织培养和再生技术在研究植物基因和基因表达方面发挥了重要的作用。

研究者们可以采取逆转录-聚合酶链式反应等方法，对植物组织进行基因表达分析，从而了解植物的基因调控机制、基因功能及其调控网络。

另外，由于组织培养和再生技术可以大规模地繁殖植物，因此它也是进行大规模基因表达分析的重要手段。

例如，在研究环境胁迫对植物基因表达的影响时，组织培养和再生技术可以为科学家们提供大量的实验材料。

植物转基因技术及其应用摘要:综合介绍了植物转基因的主要技术与其在各个领域的主要应用；对转基因植物的安全性进行了一些讨论，并对植物转基因技术的发展前景进行了展望。

自1983 年第一株转基因植物问世以来,转基因植物的研究和应用在世界各国蓬勃开展。

所谓转基因植物就是植物细胞或组织经遗传转化后,进行组织培养长出愈伤组织,再经诱导所分化出来的完整植株。

转基因可以使优良的生物基因在不同种生物之间进行交流, 从而弥补单一生物种类中的遗传资源不足,丰富种质库。

转基因植物的研究在目前的生物技术领域中最为活跃,具有十分广泛的应用前景。

1. 植物转基因技术1.1 土壤农杆菌介导转化技术革兰氏阴性菌根瘤农杆菌是一种植物病原菌,通常只能感染双子叶植物的受伤部位。

农杆菌携带一种称为Ti 的质粒,该质粒含有一段NDA ,称T-DNA(transfer-DNA) ,它能转移并整合到植物组织中,并导致冠瘿瘤的形成。

不含有Ti 质粒的土壤农杆菌不能诱导冠瘿瘤产生。

利用Ti 质粒对植物进行遗传转化的最基本方法是将目的DNA 片段插入T-DNA 区,然后通过土壤农杆菌和Ti 质粒将其送入受体植物并整合到植物细胞的基因组内,使之得到遗传转化。

2 土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法。

由于近几年来在载体系统和转化方法上的不断完善,土壤农杆菌介导的基因转移不仅局限于其天然寄主双子叶植物范围内,在转化水稻、玉米和小麦等单子叶植物上也取得了重大的突破。

例如,Ishida 等1996 年在玉米上获得了 5 %～30 %的转化率,Hiei 等1994年在水稻上获得了29 % 的转化率。

就目前的情况看,土壤农杆菌介导的基因转化关键在于找到合适的组织培养和再生技术。

1.2基因枪技术由于土壤农杆菌转化技术在单子叶植物上的局限性,目前,多数研究者倾向于使用基因枪技术对单子叶植物进行转化。

基因枪技术1987 年由Sanford 等人发明,是目前最有前途的植物DNA 转移系统之一。

植物细胞培养生产次生代谢产物的影响植物细胞培养条件温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。

通常，植物细胞培养采用25℃。

搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90―120r／min。

pH值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是重要的。

在培养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一定范围内。

植物细胞培养的适宜pH值一般为5―6。

通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。

好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。

对摇瓶试验，通常500m1的三角瓶内装80―200m1的植物细胞培养液较适宜。

当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。

试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。

光：光对植物有着特殊的作用。

光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。

研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。

细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况、生长与物质生产能力差异显著。

而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不一样。

通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。

接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。

在再次培养中，往往取前次培养液的5―20％作为种液，也以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为15―50g(湿细胞)／L。

由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。

影响植物细胞培养的因素植物细胞生长和产物合成动力学也可分为三种类型：①生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；②中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合成也停止；③非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。

事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。

植物细胞培养和植物细胞培养装置摘要:本文概括介绍了生物工业中植物细胞培养方法及其应用,对商业上应用的植物细胞培养装置进行了比较详细介绍,其中,重点介绍了植物细胞培养装置中常用的几种搅拌的结构原理和优缺点。

关键词:生物工业植物细胞培养生物反应器搅拌1 植物细胞培养及其应用植物除了可以为人类提供食物、药物外,还可以产生大量的其他有用物质,这些物质可以作为药品、色素、调味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等,其中很多极其稀少,价格昂贵。

如果用种植的方法生产这些物质,质量和产量不仅受到气候、地理和季节的很大限制,而且因为产物与很多其他物质混合,随后的分离过程十分困难复杂,因而耗资巨大。

使用大规模细胞培养技术培养植物细胞是近年来比较热门的技术之一。

用这种方法生产天然产物不受病虫害、气候、地理、季节等因素的影响,细胞产物的组成也比植物简单,因此后续的分离和提取操作也相对容易。

2 植物细胞培养和动物细胞培养的区别像动物细胞一样,植物细胞不但生长缓慢,而且很脆弱,容易受到搅拌和气泡破裂产生的剪切力的伤害。

但是,与动物细胞不同,植物细胞在培养方面有以下优势。

圆盘平直叶涡轮搅拌时产生的剪切力较大,对植物细胞伤害比较严重。

后来,有人使用锚式搅拌(anchor)和螺旋式搅拌(spiral)进行植物细胞的培养,取得了较好的效果。

使用这两种搅拌的植物细胞培养反应器如图2所示。

Ulbrich(1985)等比较了培养彩叶草(Coleus)细胞时锚式搅拌和螺旋搅拌的混合效果,认为螺旋式搅拌效果最优。

3.3 吸筒式搅拌(cell-lift impeller)和帆式搅拌(sail impeller)吸筒式搅拌(cell-lift impeller)和帆式搅拌(sail impeller)也常用于植物细胞的悬浮培养中,其结构如3所示。

吸筒式搅拌器中间是一个桶状中空轴,上端封住,下端开口。

在空轴的上部,连有三根短管向外伸展,互成120度角。

短管内部与中空轴内腔相连。

生物反应器技术的应用在现代生物科技领域，生物反应器是一个至关重要的工具，它是一种能够模拟自然界生物过程的人造设备，用来培养、维持生物体、微生物、细胞等生物材料的种植和发育的机器。

在近年来，随着生物工程技术的发展和应用，生物反应器已经成为一种重要的科技手段，被广泛应用于生物基因工程、微生物发酵、制药等领域，对人类健康事业、食品生产等多个方面产生了深刻的影响。

生物反应器概述生物反应器是一种工程设备，其功能是提供一种适宜的环境和场所，使生物体、微生物、细菌等生物材料能够正常生长和发育。

生物反应器的主要部件包括反应器本体、搅拌器、气体增加装置、离心机等。

反应器本体的构成主要包括反应器柱体、反应器罩和反应器轴等，通常是由不锈钢或其他材质制成，具有高强度、不易生锈的特点。

搅拌器则能够提供足够的氧气和营养物质，以促进生物体或微生物的增殖，从而实现她们的长期生长与发育。

气体增加装置则能够根据反应器内气体的需要自动进行释放气体或增加压力，从而保证反应器内的恒定气体环境，提高反应器的工作效率和稳定性。

离心机则是对生物反应器中培养好的细胞、微生物等生物材料进行离心分离，分离其有效成分，并将其提取出来，用于后续的生产加工、分析等操作。

生物反应器分类按照生物反应器中介质物质不同分类，可以将生物反应器分为液体生物反应器和固体生物反应器，其中液体生物反应器应用更为广泛。

液体生物反应器主要应用于细胞、蛋白质等大分子物质的培养，以及微生物发酵等领域。

按照反应器的体积大小，液体生物反应器通常可以分为微型反应器、小型反应器、中型反应器和大型反应器等。

微型反应器的体积通常不到1毫升，主要用于在实验室中进行生物材料的初步筛选，小型反应器一般在1~100升之间，主要用于生产中较小批量的生物材料生产。

中型反应器的体积在100~5000升之间，主要用于中等批量的生物材料生产，以及研究性项目中的规模制备。

大型反应器的体积在5000~30000升之间，主要用于工业规模生产，能够应对大规模生产所需的产出量。

植物细胞培养技术是近年来备受关注的研究领域，它可以为医药、农业和工业等领域提供大量的天然产物。

而在植物细胞培养中，次生代谢产物的产量一直是一个重要的研究课题。

那么，如何提高植物细胞培养中次生代谢产物的产量呢？本文将从不同角度探讨这一问题。

1. 优化培养基配方培养基是植物细胞培养中至关重要的因素之一，它直接影响着细胞的生长和代谢产物的合成。

通过优化培养基的配方，可以提高细胞的生长速度和产物的产量。

添加适量的植物生长调节物质、有机氮源和微量元素等，可以促进植物细胞的生长和次生代谢产物的合成。

2. 生物反应器的选择生物反应器对于植物细胞培养中产物产量的影响也非常重要。

不同类型的生物反应器具有不同的气液传质性能和培养条件控制性能，选择合适的生物反应器能够提高细胞的生长速度和产物的产量。

旋转式生物反应器可以提供良好的气液传质性能，有利于细胞的生长和代谢产物的合成。

3. 基因工程技术利用基因工程技术可以改变植物细胞的代谢途径，提高次生代谢产物的产量。

通过转基因技术引入相关基因，可以增加代谢途径的通量，促进次生代谢产物的合成。

利用基因沉默技术也可以抑制竞争性代谢途径，增加目标产物的积累。

总结回顾：提高植物细胞培养中次生代谢产物的产量是一个复杂而又具有挑战性的问题，需要综合考虑培养条件、生物工程技术等多个因素。

优化培养基配方、选择合适的生物反应器和利用基因工程技术是提高产物产量的重要途径。

未来，随着科学技术的不断发展，相信我们能找到更多有效的方法来解决这一问题。

个人观点：我认为，提高植物细胞培养中次生代谢产物的产量是一个持续而又有意义的研究领域。

通过不断探索和创新，我们可以为人类社会提供更多天然产物，推动生物技术领域的发展。

希望未来能有更多的科研人员投入到这一领域，共同解决这一挑战。

植物细胞培养技术的研究在近年来得到了巨大的关注和发展。

通过这项技术，研究人员可以利用植物细胞生长的特性来合成大量的次生代谢产物，这些产物对医药、农业和工业领域具有重要的应用前景。