基于双巯基化合物和纳米金固定生物分子的研究

蛋白分子成药性评价简述摘要近些年来，治疗性抗体及抗体类蛋白已经成为欧美新批准药物的一大组成部分，此类药物的临床试验数量呈迅速增长的趋势。

一个可成功开发成商业化药物的治疗性蛋白，不仅应具有理想的药效、安全性和药代动力学特性，还应具有理想的理化特性，使得其稳定性能够满足生产、制剂工艺的技术要求。

这一系列理化特性的评价，也称为“成药性”或“可生产性”评价。

本文总结了目前成药性评价方法的研究进展。

关键词：治疗性蛋白、成药性、可生产性、理化性质、稳定性、制剂前言近年来，基于单克隆抗体的治疗性药物成为了制药企业研发管线中最重要的一部分。

据统计，2016年处于临床研究中的抗体类药物分子数量在已超过了470个[1]，适应症范围覆盖了肿瘤、自身免疫、眼科及一些罕见病等多个方面。

大分子蛋白药物在原液、制剂生产，及临床给药时常遇到的一个问题是蛋白的不稳定性。

一方面由于蛋白质天然的稳定性显著低于小分子化药，另一方面为了达到天然蛋白所不具有的治疗特性，研究者们还应用蛋白质工程设计出了各种非天然蛋白，如双特异性抗体、融合蛋白等。

而同时这些非天然蛋白的稳定性常常更加成为问题。

一些理化特性较差的蛋白常常在生产、储存、给药过程中出现研究者不想看到的化学修饰、断裂和聚集等现象，这大大影响了药物的产率、活性，高分子聚集体还会造成免疫原性等方面的安全性问题。

过去很多研究机构主要基于生物学活性来筛选候选分子，其可生产性的相关影响因素在分子发现阶段并未纳入考量范围。

但这些分子常常在推进到后期生产工艺开发阶段时，遇到稳定性等技术方面的问题而无法顺利商业化，从而导致大量资源被浪费。

近5年来，越来越多的研发机构开始将成药性评价也纳入蛋白药物发现阶段，以得到最佳的药物分子。

与小分子药物已有简单成熟的成药性评价标准：“里宾斯基五规则”[2]不同，大分子药物的成药性评价目前尚无类似的评价标准。

本文结合近年来各方面的研究进展，将所报道的各种大分子成药性评价方法进行了综述。

纳米材料应用于DNA检测领域的研究进展洪敏;朱进;尹汉东【摘要】Recent progress in application of nanomaterial for DNA detection except for PCR systems is reviewed. Nanomaterial-(nanoparticles and nanowires/tubes) or nanofabrication-based DNA detection methods are introduced. Studies reveal that nanomaterial-based DNA detection methods offer several advantages over the traditional PCR systems in the orientation, visualization and multiplexing. Especially, in the research of nanomaterial-based detection, methods with nanoparticle are studied, including colorimetrical detection, fluorescent detection, resonance light scattering detection, scanometric detection, surface-enhanced Raman scattering detection, bio-bar-code detection, electrochemical detection, MALDI-TOF MS detection, and elemental analysis detection. For the nanofabricationbased DNA detection, four methods are presented: nanopatterning, nanoelectromechnical devices,nanopore, and microarray detection methods.%本文主要评述了近年来纳米材料在除了PCR领域以外的DNA检测方面的研究进展.对以纳米材料(纳米粒子、纳米纤维、纳米线、纳米管)为单元,或以纳米器件的制备为实验方法而开展的DNA检测方面的工作进行了介绍.研究表明,基于纳米材料的DNA检测法,无论是在定位、可视化还是多重检测等方面都比传统PCR技术的检测方法表现出其自身的优越性.在以纳米材料为单元的研究中,基于纳米粒子标记的DNA检测方法研究的最多.本文分别进行了例证说明,具体内容包括:比色法、荧光检测法、共振光散射法、表面增强拉曼光谱法、电化学法、MALDI-TOF质谱分析法、元素分析法.而围绕纳米器件制备方法开展的DNA检测研究中,从4个方面进行了介绍:纳米排列图案法、纳米电机械设备法、纳米孔检测法和微排列检测法.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2011(039)001【总页数】9页(P146-154)【关键词】纳米材料;DNA检测;灵敏度;选择性;综述【作者】洪敏;朱进;尹汉东【作者单位】聊城大学化学化工学院,聊城,252059;南京大学化学化工学院,南京,210093;聊城大学化学化工学院,聊城,252059【正文语种】中文2010-05-05收稿;2010-08-26接受本文系山东省自然科学基金(No.2R2010BQ021)和聊城大学引进博士科研启动经费项目(2009)资助DNA是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础。

纳米金标记抗体增强SPR检测大肠杆菌O157∶H7刘霞;李蓉卓;李蕾;李文进;周春娇【摘要】将金纳米粒子(AuNPs)标记的大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)的多克隆抗体(PAb)作为二抗,采用氨基偶联法将PAb固定在传感器表面作为一抗,通过三明治方法用双通道表面等离子体子共振(SPR)传感器对E coli O157∶H7进行检测,并与SPR直接法检测进行了比较.结果表明,直接法的检出限为103 cfu/mL,线性范围为103 ～ 109 cfu/mL；AuNPs增强三明治法的检出限为10 cfu/mL,线性范围为10～1010 cfu/mL,灵敏度比直接法提高了100倍,且具有更宽的检测范围.本方法不仅检测时间短,而且具有良好的选择性和重现性.%The anti-E,coli O157 ∶ H7 polyclonal antibodies (PAb) were labelled with Au nanoparticles (AuNPs),which was used as secondary antibodies.The PAb,which was used as primary antibodies,was immobilized on the sensor surface with amino coupling method.The E.coli O157 ∶ H7 was detected using direct assayand enhancing sandwich assay based on the two channels surface plasmon resonance (SPR) biosensor.The result indicated a good linear relationship between the SPR signal and logarithmic value of E.coli O157∶H7 concentration ranging from 103 cfu/mL to 109 cfu/mL,with the limit of detection (LOD) of 103 cfu/mL for the direct assay.For AuNPs enhancing sandwich assay,the linear range and the limit of detection were determined to be 10-1010 cfu/mL and 10 cfu/mL,respectively.The sensitivity is 100 times higher than that of direct detection.By introducing AuNPs-PAb compound,a wider detection range and lower detection limitcould be obtained.This method is rapid,and has good selectivity and reproducibility.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2013(034)006【总页数】6页(P1333-1338)【关键词】金纳米粒子;大肠杆菌O157∶H7;表面等离子体子共振;标记;检测【作者】刘霞;李蓉卓;李蕾;李文进;周春娇【作者单位】湖南农业大学食品科技学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,理学院,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】O657大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)是肠出血性大肠埃希氏杆菌的一个主要菌型［1］，受其污染的牛肉、牛奶、鸡肉、蔬菜及果饮料等均可成为传播媒介.人感染E.coli O157∶H7后，轻者会出现短暂腹泻、恶心及呕吐等症状，重者则导致剧烈腹痛、出血性结肠炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合症等［2］.因此，对E.coli O157∶H7进行快速、灵敏、实时检测具有重要的应用价值.传统的微生物培养法［3，4］、生物发光法及细胞计数法等的检测时间长(一般为1～3 d)且灵敏度低，不能完全满足E.coli O157∶H7的检测要求.近年来，分子生物学、免疫学及生物传感器等技术被用于E.coli O157∶H7的检测与鉴定.巢强国等［5］利用聚合酶链式反应(PCR)法检测食品中的E.coli O157∶H7，其检出限可达2.0 cfu/mL.Yu等［6］通过时光分辨荧光免疫分析，采用三明治法检测了苹果酒中的E.coli O157∶H7，将单克隆抗体连接在免疫磁珠上作为捕获抗体，以铕标记的同一抗体作为检测抗体，可在6 h内检出10～100 cfu/mL的细菌.Li等［7］利用化学发光磁酶免疫法对E.coli O157∶H7进行了检测，将兔抗E.coliO157∶H7修饰的磁性纳米颗粒充分结合E.coli O157∶H7后，与鼠抗E.coliO157∶H7的单克隆抗体结合，然后采用碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG与上述复合物结合，再加入碱性磷酸酶的特异性底物进行E.coli O157∶H7的检测，该方法检出限为103 cells/mL，完整的检测时间约为3 h.Xu等［8］应用电化学传感器，分别采用羧基化多壁碳纳米管、戊二醛及3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰的电极检测E.coli O157∶H7，结果显示戊二醛修饰的电极的电信号最强，在1.0×103～1.0×107 cells/mL范围内呈线性关系，检出限为8.0×102 cells/mL.免疫生物传感器是一种特异性强、快速且简便的检测技术，已广泛应用于微生物的检测.尤其是表面等离子体子共振(SPR)［9］技术不同于其它传感技术，其具有无需标记、实时监测、操作简单及灵敏度高等优点，已被广泛应用于多个研究领域［10～13］.目前，多数利用SPR生物传感器检测E.coli O157∶H7的研究是基于生物素-亲和素系统放大原理.王凯等［14］通过亲和素-生物素系统放大响应信号，并引入复合抗体作为二抗，应用SPR传感器对E.coli O157∶H7进行检测，其检出限达到105 cfu/mL，并建立了细菌浓度与折射率对应的标准曲线，整个检测过程可在1 h内完成.Wang等［15］利用SPR建立消减抑制反应法检测E.coliO157∶H7，其检出限为3.0×104 cfu/mL.他们又引入生物凝集素作为受体进行检测［16］，检出限下降至3.0×103 cfu/mL.金纳米粒子(AuNPs)因其折射率大、易于标记且用量少等优点成为增强SPR响应信号的有效方法［17］.目前，AuNPs已成功地应用于酶［18］、DNA［19］和抗体［20～22］等各种生物分子的标记.本文将AuNPs(粒径17.79 nm)标记E.coli O157∶H7的多克隆抗体(PAb)制备的AuNPs-PAb复合物作为二抗，以PAb为一抗，采用三明治夹心法［23］，应用双通道SPR传感器(一个通道作为参比通道)对E.coli O157∶H7进行检测，并与SPR直接法检测结果进行了比较.本文方法不仅检出限低，线性范围广，而且简便、快速，具有广阔的应用前景.1 实验部分1.1 试剂与仪器N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDC)及3-巯基丙酸(MPA)购于Sigma-Aldrich上海分公司;E.coli O157∶H7和肠致病性埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia Coli，ECEP)由湖南省食品药品检验研究院提供;羊抗E.coli O157∶H7 PAb购于美国International Lab;无水乙醇、营养肉汤(Nutrient broth，NB)、四氯金酸(HAuCl4·H2O)、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白(BSA)和其它化学试剂均购于国药集团;实验所用试剂均为分析纯.PBS缓冲液(150 mmol/L NaCl+20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH=7.4);AuNPs为本实验室合成;实验用水为去离子水;实验所用玻璃器皿、PBS缓冲液、去离子水及枪头均经高压灭菌.HJ-1型恒温磁力搅拌器(江苏医疗仪器厂);UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);双通道2000 SPR传感器和芯片(美国Biosensing Instrument 公司);JSM-6380LV型透射电子显微镜(日本电子株式会社).1.2 实验过程1.2.1 E.coli O157∶H7/ECEP的培养及平板计数法将用甘油保存的E.coliO157∶H7/ECEP置于NB培养液中，在37℃的恒温箱中培养24 h后，达到其繁殖平台期.用PBS缓冲液以10倍的间隔稀释10次，取100μL稀释液滴在营养琼脂平板上，混合均匀.于37℃培养24 h后，数出平板上的菌落数，从而得到每毫升的菌落数(cfu/mL).1.2.2 AuNPs的制备参照文献［24］方法，采用柠檬酸三钠还原法制备AuNPs.取0.5 mL 1%(质量分数)的氯金酸水溶液置于圆底烧瓶中，加入49.5 mL去离子水，用恒温磁力搅拌器以200 r/min转速搅拌加热至沸腾后，快速加入新配制的1 mL 1%(质量分数)的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌10 min.溶液由灰色变成黑色，最后变成透亮的红色，停止加热，再搅拌10 min.室温下冷却后分装到离心管中，储存于4℃冰箱中备用.1.2.3 AuNPs-PAb复合物的制备参照文献［25～27］，采用目测法确定PAb的最佳标记量后，取适量AuNPs，用10%(质量分数)的K2CO3溶液调节pH至7.4，在搅拌下逐滴加入待标记的PAb，继续搅拌10 min后，加入同样pH值且最终质量分数为1%的BSA作为封闭剂.所得混合液以2000 r/min转速离心20 min，除去沉淀，即除去部分大颗粒的AuNPs.所得上清液以10000 r/min转速离心60 min，小心除去上清液，即除去未结合的PAb.所得沉淀用PBS缓冲液稀释，保存于4℃冰箱中备用.1.2.4 PAb的固定将SPR芯片浸入含10 mmol/L MPA的乙醇溶液中过夜，用去离子水冲洗并用氮气吹干后装入SPR仪中.待SPR仪的基线走平后，通入现配的0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液(流速40μL/min)，待MPA末端的羧基活化后，将一定浓度的PAb通入流通池，将其固定在芯片表面，然后通入1%(质量分数)的BSA封闭空位点.1.2.5 SPR检测直接法检测:向SPR仪中通入PBS缓冲液反复冲洗，待基线稳定后，以10μL/min的流速通入一定浓度的E.coli O157∶H7，观察SPR响应信号(共振角度的变化);反应完毕后用10 mmol/L NaOH和PBS缓冲液冲洗至基线稳定，加入其它浓度的E.coli O157∶H7，重复上述步骤，每个浓度至少重复检测3次.AuNPs增强三明治法检测:向SPR仪中通入一定浓度的E.coli O157∶H7，使其与芯片表面的抗体充分反应后，再通入一定浓度的AuNPs-PAb复合物，观察SPR 响应信号;反应完毕后用10 mmol/LNaOH和PBS缓冲液冲洗至基线稳定，然后加入其它浓度的E.coli O157∶H7，重复上述步骤，每个浓度至少重复检测3次.2 结果与讨论2.1 AuNPs的表征应用柠檬酸钠还原法制备了AuNPs.由AuNPs的透射电镜照片［图1(A)］可见，粒子呈较为规则的球形，分散也比较均匀;制备的AuNPs平均粒径为17.79 nm ［图1(B)］;图1(C)为AuNPs的紫外-可见吸收光谱，在520 nm处出现了紫外特征吸收峰，这与文献［28］报道一致.Fig.1 TEM image(A)，size distribution histograms(B)and UV-Vis spectrum(C)of AuNPs2.2 AuNPs-PAb 的表征AuNPs标记PAb形成的AuNPs-PAb复合物可在水溶液中均匀分散，图2为PAb，AuNPs和AuNPs-PAb的紫外-可见吸收光谱.如图2所示，在520 nm处AuNPs出现了特征吸收峰，而PAb没有特征峰，但PAb被AuNPs标记后，在523 nm处也出现了特征峰.AuNPs-PAb复合物的特征吸收峰与AuNPs的特征吸收峰相比出现了红移现象，这是由于形成AuNPs-PAb复合物后，粒子粒径变大所致［29］.此外，吸光度也明显下降，表明AuNPs-PAb复合物具有与AuNPs 相同的光学性质，PAb已被 AuNPs标记.Fig.2 UV-Vis spectra of PAb(a)，AuNPs(b)and AuNPs-PAb(c)2.3 PAb最佳固定浓度的选择在芯片表面引入MPA，其分子一端的巯基与金具有很强的结合力，另一端的羧基经EDC/NHS活化后，可与抗体发生氨基偶联反应，从而将抗体固定在传感器表面.抗体的固定浓度对于传感器非常重要，抗体浓度过高会出现层叠现象，使细菌结合位点减少或结合不牢固，同时也导致不必要的试剂浪费;浓度过低会导致传感器表面裸露的结合位点较多，增大了非特异性吸附的可能.另外，若固定的抗体量太少，将无法检测高浓度的菌液样品.实验中分别将 5个 PAb浓度(27.8，55.6，83.4，111.2和166.8μg/mL)的PBS溶液通入已活化的SPR芯片表面.图3示出了不同浓度的PAb与SPR响应信号的关系，可见随着PAb浓度的增大，SPR响应信号逐渐增加，当PAb浓度为111.2μg/mL时，SPR的响应信号最大;当 PAb 浓度为166.8μg/mL时，SPR响应信号反而下降，说明PAb浓度为111.2μg/mL 时，芯片表面所固定的PAb已达到饱和.因此，选择PAb的最佳固定浓度为111.2μg/mL.Fig.3 SPR responses of PAb immobilization at different concentrationsPAb concentration/(μg·mL－1):a.27.8;b.55.6;c.83.4;d.111.2;e.166.8.n=3.2.4 SPR免疫检测2.4.1 直接法待PAb在SPR芯片表面自组装形成稳定的抗体分子膜后，分别向流通池中通入不同浓度的E.coli O157∶H7，实时观察SPR响应信号的变化.图4曲线a为直接法检测E.coli O157∶H7的工作曲线，可见，随着E.coli O157∶H7浓度的增大，SPR的响应信号也相应增大，且在103～109 cfu/mL范围内呈良好的线性关系，线性系数R=0.9968，线性回归方程为Y=0.96939X－2.77827，检出限为103 cfu/mL.Fig.4 Calibra tion data of SPR detection of E.coli O157∶H7 by direct assay(a)and AuNPs enhancing sandwich assay(b)2.4.2 AuNPs增强三明治法待PAb在SPR芯片表面自组装形成稳定的抗体分子膜后，分别向流通池中通入不同浓度的E.coli O157∶H7，然后通入AuNPs-PAb 复合物进行检测，整个实验过程的SPR动力学曲线如图5(A)所示.可见，通入PAb后立刻引起SPR共振角度的变化，1200 s时基本达到平衡，说明PAb已经固定在传感器表面.用PBS冲洗传感器表面并注入BSA也引起SPR共振角度的变化，说明传感器表面空位点已被BSA封闭.此时，注入E.coli O157∶H7引起的SPR响应信号不大，当E.coli O157∶H7完全与一抗结合后，再注入AuNPs-PAb的复合物时，SPR共振角度明显改变，说明AuNPs标记抗体具有增强响应信号的作用.图4曲线b为AuNPs增强三明治法检测E.coli O157∶H7的工作曲线，可见，检测相同浓度的E.coli O157∶H7时，AuNPs增强三明治法的SPR响应信号远高于直接法，且随着E.coli O157∶H7浓度的增大，信号增幅也越大.在 E.coliO157∶H7浓度均为106 cfu/mL时，增强法的SPR响应信号(16.603 mdeg)为直接法(4.855 mdeg)的3.5倍.这主要是由于AuNPs比表面积增大了PAb的承载量，使复合物的折射率明显增大，且AuNPs的表面等离子体子与金膜本身的表面等离子体子发生了耦合所致.增强法的检出限也降至10 cfu/mL，比直接法低了100倍;其线性检测范围为10～1010 cfu/mL，线性系数R=0.9914，线性回归方程为Y=2.02254X+1.66623.图5(B)为AuNPs增强三明治法SPR检测不同浓度E.coli O157∶H7的动力学曲线.可见，随着E.coli O157∶H7浓度的增大，SPR响应值也随之增大.当抗原与抗体结合达到平衡时，即SPR基线达到稳定时，SPR响应值与E.coli O157∶H7的浓度成正比，当E.coli O157∶H7浓度为1010cfu/mL时，SPR响应值最大(21.382 mdeg)，浓度为10 cfu/mL时，其响应值最小(3.6805 mdeg).Fig.5 SPR dynamics curve of AuNPs enhancing sandwich assay(A)and detection of E.coli O157∶H7 at different concentrations(B)(B)c(E.coliO157∶H7)/(cfu·mL－1)from a to f:1010，108，106，104，102，10.2.5 免疫传感器的特异性和再生性以ECEP为对照，考察了该免疫传感器的特异性，分别用AuNPs增强三明治法对相同浓度(106 cfu/mL)的E.coli O157∶H7和ECEP进行SPR检测.结果表明，E.coli O157∶H7的SPR响应信号是ECEP的3倍以上，说明该方法对E.coliO157∶H7具有较高的选择性.图6为E.coli O157∶H7和ECEP分别与AuNPs-PAb复合物相互作用的TEM照片.由图6(A)可见，AuNPs-PAb分散在E.coliO157∶H7的菌体周围并与之结合，而图6(B)中的AuNPs-PAb只在ECEP周围，并未与之结合，进一步说明该方法具有很高的特异性.此外，采用不同批次合成的AuNPs-PAb对不同批次培养的相同浓度的E.coli O157∶H7进行了检测，所得结果基本一致.传感器的再生性是其具有实际应用价值的重要指标，每次检测 E.coliO157∶H7后均用 10 mmol/L NaOH冲洗传感器表面5 min，以洗脱免疫结合物，再用PBS缓冲液冲洗至基线稳定，可实现传感器的再生.图7曲线a～g分别为同一芯片检测相同浓度E.coli O157∶H7(106 cfu/mL)的第1，5，10，15，20，25和30次的动力学曲线.可见，AuNPs-PAb与固定在传感器表面的E.coliO157∶H7经结合，解离，最终达到结合平衡时，引起的SPR共振角度的变化基本一致，因此该传感器可重复使用30次.此外，常温下该抗体修饰的SPR芯片可在仪器上连续进行实验4～5 d，抗体的活性基本保持不变.Fig.6 TEM images of the interaction for E.coli O157∶H7(A)and ECEP(B)with AuNPs-PAbFig.7 SPR dynamics curves for E.coli O157∶H7(106 cfu/mL)at different detection timesa.1st;b.5th;c.10th;d.15th;e.20th;f.25th;g.30th.3 结论以粒径为17.79 nm的AuNPs作为抗体的载体，将制备的AuNPs-PAb复合物作为二抗，利用双通道SPR传感器，采用三明治方法检测了E.coli O157∶H7，检出限为10 cfu/mL，比直接法降低了100倍，扩大了检测范围.该方法检测时间短、试剂用量少且具有良好的选择性和重现性.参考文献【相关文献】［1］ Ahn C.K.，Klein E.，Tarr P.I.，Clin.Infect.Dis.，2008，46(8)，1197—1199［2］ Pillips C.A.，J.Sci.Food Agric.，1999，79(11)，1367—1381［3］ Kim S.H.，Park M.K.，Kim J.Y.，Chuong P.D.，Lee Y.S.，Yoon B.S.，Hwang K.K.，Lim Y.K.，J.Vet.Sci.，2005，6，41—46［4］ Lei C.X.，Hu S.Q.，Gao N.，Shen G.L.，Yu R.Q.，Bioelectrochem.，2004，65，33—39［5］ Chao Q.G.，Yang X.M.，Ge Y.，Xiong W.，Qu Q.F.，Wang R.Y.，Food Sci.，2010，31(8)，212—215(巢强国，杨学明，葛宇，熊薇，曲勤凤，王瑞元.食品科学，2010，31(8)，212—215)［6］ Yu L.S.，Reed S.A.，Golden M.H.，J.Microbiol.Methods，2002，49(1)，63—68 ［7］ Li Z.Y.，He L.，He N.Y.，Shi Z.Y.，Wang H.，Li S.，Liu H.N.，Li X.L.，Dai Y.B.，Wang Z.F.，J.Nanosci.Nanotech.，2010，10，696—701［8］ Xu L.J.，Du J.J.，Deng Y.，He N.Y.，J.Biomed.Nanotech.，2012，8(6)，1006—1011 ［9］Liu Q.，Zhang Z.，Qi Z.M.，Chin.J.Anal.Chem.，2012，40(4)，556—562(柳倩，张喆，祁志美.分析化学，2012，40(4)，556—562)［10］ Atoui A.，Dao H.P.，Mathieu F.，Lebrihi A.，Mol.Nutr.Food Res.，2006，50(6)，488—493［11］ Roche P.J.R.，Ng S.M.，Narayanaswamy R.，Goddard N.，Page K.M.，Sens.Actuators B，2009，139(1)，22—29［12］ Forzani E.S.，Foley K.，Westerhoff P.，Tao N.J.，Sens.Actuators B，2007，B123(1)，82—88［13］ Piliarik M.，Parova L.，Homola J.，Biosens.Bioelectron.，2009，24(5)，1399—1404［14］ Wang K.，Yin Y.G.，Transducer and Microsystem Technologies，2007，26(5)，12—17(王凯，殷涌光.传感器与微系统，2007，26(5)，12—17)［15］ Wang Y.X.，Ye Z.Z.，Si C.Y.，Ying Y.B.，Sensors，2011，11，2728—2739［16］ Wang Y.X.，Ye Z.Z.，Si C.Y.，Ying Y.B.，Food Chem.，2013，136，1303—1308 ［17］ Lin Z.，Liu X.，Li Y.，Food Sci.，2011，32(5)，342—350(林钊，刘霞，李迎.食品科学，2011，32(5)，342—350)［18］ Du D.，Chen S.，Cai J.，Zhang A.，Biosens.Bioelectron.，2007，23(1)，130—350［19］ Zou N.L.，Zang Y.C.，Mao H.J.，Zhao G.Q.，Jin Q.H.，Zhao J.L.，Xu Y.S.，Chin.J.Anal.Chem.，2012，40(4)，569—573(邹能利，臧玉翠，毛红菊，赵国强，金庆辉，赵建龙，徐元森.分析化学，2012，40(4)，569—573)［20］ Choi J.W.，Kang D.Y.，Jang Y.H.，Kim H.H.，Min J.H.，Oh B.K.，Colloids Surf.A，2008，313—314，655—659［21］ Mao X.，Jiang J.H.，Luo Y.，Talanta，2007，73(3)，420—424［22］ Mao S.，Lu G.H.，Yu K.H.，Chen J.H.，Carbon，2010，48(2)，479—486［23］ Safenkova I.V.，Zherdev A.V.，Dzantiev B.B.，J.Immunol.Methods，2010，357(1/2)，17—25［24］ Frens G.，Nature，1973，241，20—22［25］ Jan W.S.，Hans J.G.，J.Cell Biol.，1981，90(2)，533—536［26］ Wang B.L.，Scopsi L.M.，Nielsen H.M.，Larsson L.I.，Histochemistry，1985，83，109—115［27］ Wang K.，Rapid Assay for Microbe Using SPR Biosensor，Jilin University，Changchun，2003(王凯.使用SPR生物传感器快速检测微生物的实验研究，长春:吉林大学，2003)［28］ Sun X.L.，Zhang Y.Z.，Shao J.D.，Zeng J.，Chem.J.Chinese Universities，2007，28(8)，1449—1453(孙秀兰，张银志，邵景东，曾洁.高等学校化学学报，2007，28(8)，1449—1453)［29］Fátima F.，Francisco S.B.，Marco M.P.，Biosens.Bioelectron.，2012，34，151—158。

2009年第67卷化学学报V ol. 67, 2009第18期, 2144～2148 ACTA CHIMICA SINICA No. 18, 2144～2148* E-mail: jiachp@Received November 26, 2008; revised March 19, 2009; accepted April 28, 2009.No. 18 包华等：基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法2145DNA芯片技术是近年来兴起的一种快速、高敏感、高度集成化的基因检测技术. 基因芯片是将大量的核酸片段有序地固化于硅衬底或玻璃上构成, 与已标记的待测样品分子杂交, 通过特定的仪器对杂交信号进行检测, 从而快速、并行、高效地检测分析样品中的靶分子含量[1]. 在基因突变和基因诊断等领域已获得应用. 但是, 在用基因芯片检测时, 由于其检测灵敏度的限制, 样品中核酸往往需先经过PCR扩增, 才能检测出来, 操作复杂、检测时间长、易污染且费用高, 大大限制了在医学临床诊断方面的广泛应用[2,3].基于纳米材料的检测技术是最近十年来迅速发展起来的一项临床检测技术. 纳米材料尤其是纳米金, 具有很好的生物相容性, 颗粒直径小, 体表面积大[4], 可标记大量生物分子, 并且标记于纳米材料表面的生物分子之间的结合能力大大提高[2,3,5], 例如标记了纳米金的核酸具有更高的杂交特异性, 而且寡核苷酸的修饰也更有利于胶体金的稳定[6]. 最引人注意的是Mirkin实验室[7]提出的一种基于纳米金探针Bio-Bar-Code Amplification (BCA)扩增技术, 该技术中纳米金探针表面修饰了起信号放大作用的条形码DNA和与靶核酸互补的DNA探针, 当有靶核酸存在时, 磁微粒、靶核酸、纳米金探针形成“三明治”复合结构, 复合物经磁场分离, 富集的纳米金探针热变性, 释放条形码DNA, 对其进行银染或PCR检测, 间接检测靶核酸的量. 这种BCA检测方法通过多次信号放大, 可高灵敏度检测低至1 amol/L的核酸, 但因具有检测过程复杂、操作时间长、步骤繁多等局限性, 大大限制了在临床方面的广泛应用[7]. 该实验室正于各方面进行改进, 以进一步简化操作步骤, 提高其适用性[7].近年来, 将DNA探针结合于金纳米颗粒上构成纳米金生物分子复合探针, 通过与靶DNA的杂交互补结合比色法、荧光、电化学及银染等检测方法构建新的DNA检测方法[8,9], 已成为一种趋势. 有文献[10]报道运用凝胶电泳鉴别结合靶DNA的纳米金探针, 可检测经PCR扩增的核酸浓度为100 fmol/L. Maeda等[11]用比色法检测靶DNA, 结合了靶DNA的纳米金探针在一定的盐离子浓度下会聚集, 能检测DNA的浓度为50～500 μmol/L. 此外莫志宏等[12]、Franco等[13]也通过纳米金凝聚变色效应原理, 采用比色法检测目标靶DNA的存在, 但检测灵敏度不高. Mo等[14]通过靶DNA置换出结合到纳米金长探针上的荧光短探针, 使淬灭的荧光发光从而验证被测DNA的存在, 其检测灵敏度得到提高为50 pmol/L. 电化学DNA探针的检测方法是目前比较流行的一种生物检测方法, 但需特定电化学仪器对信号进行检测[15～17]. 如运用TBR标记的纳米金探针结合靶DNA, 通过直接检测TBR电化学发光来确定靶DNA的存在. 这种方法可直接检测未经提纯的生物样本, 简单, 可检测最低浓度为1 fmol/L的核酸[18]. 此外Lin等[19]运用磷酸镉修饰的纳米金探针与核酸突变位点完全互补结合, 通过电化学溶出分析镉含量来确定被测突变核酸的量, 可检测21.5 amol/L的突变核酸.虽然上述方法都对纳米金用于DNA生物检测进行了一定的研究, 但仅仅局限于实验室的研究, 目前在临床诊断中尚未能应用. 本文介绍一种新的基因芯片结合纳米金探针检测DNA的方法, 即在纳米金表面按照一定的比例, 同时标记与靶DNA互补的检测DNA探针和带有荧光的信号探针构成纳米金探针, 利用荧光纳米金探针的信号放大作用, 获得较高的检测灵敏度, 并利用此方法检测P53基因. P53是一种抑癌基因, 它的缺失、突变或失活与多种肿瘤的发生有关, 据统计, 50%的肺癌患者体内发生p53基因突变[20]. P53基因是肺癌中突变率最高的基因, 并在肺癌发生早期及癌前病变就发生突变[20], 因此P53基因突变的检测对肺癌早期诊断有重要的指导意义.1 材料与方法1.1 试剂与仪器1.1.1 试剂纳米金溶液、基因芯片由本实验室自行制备; 杂交缓冲液, 购自罗氏公司; 鱼精DNA, 吐温20 (Tween 20), 牛血清蛋白(BSA), 聚乙二醇(PEG8000)购自Sigma公司; 胶体金重悬液(0.1 mol/L PB, 蔗糖); 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PB) (pH 7.2 0.2 mol/L Na2HPO4, 0.2 mol/L NaH2PO4);0.1 mol/L 磷酸缓冲生理盐水(PBS); 0.1 mol/L NaCl; 0.2×洗液(SSC: 0.1%十二烷基磺酸钠(SDS), 0.03 mol/L NaCl, 0.3 mmol/L C6H5Na3O7•2H2O); 银染液; NaNO3洗液.如表1所示, 所需探针序列均由TakaRa公司合成.表1 核酸探针序列表Table 1 DNA sequences名称探针序列靶DNA P53DNA 5'-gTggCTCCTgACCTggAgTCTTCCA(T)16ATgggCCTCCggTTCATgCC-3' 芯片表面的捕捉探针NH2-P531 5'-(NH2)-(T)16-ggCATgAACCggAggCCCAT-3'纳米金上的检测探针SH-P532 5'-TggAAgACTCCAggTCAggAgCCAC(T)10-(SH)-3'纳米金上的信号探针Cy5-BP1-SH 5'-(SH)-(CH2)6-(T)10AgCTACgAgTTgAgAATCCTgAATgCgACg(T)10(CY5)-3'2146化学学报V ol. 67, 20091.1.2 主要仪器芯片点样仪(型号为Prosys 5510A)、芯片扫描仪(型号为Gene Pix 4000 B), 紫外-可见光光谱仪(型号为J∧S.C.O V-670 spectrophtometer)等.1.2 芯片制备芯片点样仪将NH2-P531探针修饰于芯片(表面醛基化)表面, 点直径100 μm, 点间距500 μm, 点样量为0.7 nL, DNA探针浓度为75 μmol/L.1.3 纳米金探针制备1.3.1 纳米金颗粒的制备配制1 mmol/L的HAuCl4, 38.8 mmol/L柠檬酸三钠溶液. 按预先设计的反应条件量取250 mL HAuCl4加热并搅拌10 min, 快速加入柠檬酸三钠溶液, 颜色由浅黄迅速变为深红时, 再持续搅拌15 min, 待溶液冷却至室温, 用硝酸纤维薄膜过滤器过滤, 即可得到纳米金溶液.1.3.2 纳米金探针标记纳米金颗粒表面标记有两种巯基修饰的DNA探针: 一种是带有Cy5荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作用; 第二种是能与靶DNA另一部分互补的检测探针P532.纳米金探针的标记方法: 取浓度为10 nmol/L的10 nm纳米金溶液1 mL, 9000 r/min离心50 min, 去上清, 100 μL无菌去离子水重悬; 加入体积比为1∶5, 浓度均为100 μmol/L的两种DNA探针共5 μL, 使总探针的终浓度为5 μmol/L, 室温放置16 h以上; 分3次逐渐加入1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L PB (pH 7.2)至终浓度分别为0.1 mol/L, 10 mmol/L, 充分混匀, 室温放置48 h以上; 用0.01 mol/L PB (0.1 mol/L NaCl)溶液9000 r/min离心50 min洗2次, 胶体金重悬液洗1次, 去上清, 再加100 μL 的胶体金重悬液, 4 ℃储存备用. 用紫外-可见光光谱仪测其吸光光谱及OD值; 用透射电镜扫描DNA探针标记前后的纳米金.1.4 芯片杂交检测过程: 3 μL待测DNA与16 μL杂交液混匀, 均匀滴于芯片上, 48 ℃杂交1 h, 0.2×SSC洗液清洗芯片1 min, 晾干待用. 3 μL纳米金探针溶液与16 μL杂交液(1%鱼精DNA, 0.05% Tween)混匀, 室温封闭30 min. 封闭后的纳米金溶液均匀滴于晾干芯片的点阵区, 48 ℃杂交, 1 h. 0.2×SSC洗液, 避光清洗芯片1 min, 晾干. 芯片扫描仪扫检测荧光信号(图1).2 结果与分析讨论2.1 纳米金探针制备及表征结果分析如TEM图2a, 图2b所示, 未标记DNA探针的纳图1 纳米金探针标记过程和DNA检测过程示意图Figure 1 Schematic of preparation of AuNP probes and hy-bridization procedure米金颗粒周围界面清晰, 而标记后的纳米金颗粒周围存在一圈灰黑色的“晕”环, 表明DNA探针已标记到纳米金颗粒表面, 并且由图可见DNA探针的标记并未使纳米金颗粒聚集, 其仍稳定存在, 分散性好. 纳米金随粒径的增大, 对应吸收峰的峰位呈现向长波段红移的趋势[21,22]. 从图2c光谱扫描图可以看出, 标记了DNA探针的纳米金最大吸收峰的波长后移了4.0 nm(标记前后最大吸收峰波长分别是520和524 nm). 波峰的移动说明DNA分子标记到纳米金颗粒的表面, 使纳米金粒子尺寸和形状有所改变[21], 从而改变了纳米金颗粒的光谱特征.图2 标记DNA探针前后的纳米金TEM图和紫外-可见光光谱扫描图Figure 2 Scanning results of AuNP probes with TEM and UV-Vis spectrum(a), (b) represents the TEM figure of AuNPs before and after modified by DNA probes, respectively; (c) represents it's UV-Vis spectrum2.2 核酸检测结果与分析基因芯片常用的荧光探针检测法: 即直接用带有荧No. 18包 华等：基于纳米金探针和基因芯片的DNA 检测新方法2147光分子Cy5的信号探针同芯片上的捕捉探针杂交并检测相应的荧光信号. 荧光探针直接检测核酸方法(图3a)检测核酸分子的最低浓度为1 nmol/L, 结果见图4.图3 基于基因芯片的三种不同检测方法的比较示意图 Figure 3 Schematic of different DNA detection methods based on the gene chip(a), (b), (c) represents fluorescent DNA probes; fluorescent gold nanoparticleprobes; gold nanoparticle probes and silver staining, respectively图4 荧光探针直接检测不同浓度靶核酸的芯片扫描结果图 Figure 4 Results of detected DNA with fluorescent DNA probes(a) 10－8mol/L; (b) 10－9mol/L; (c) 0 mol/L本文中采用荧光纳米金探针结合基因芯片的检测方法(图3b), 所用纳米金探针上检测探针与信号探针比例为1∶5, 可以检测最低浓度为1 pmol/L 的靶核酸分子, 检测信号好, 点阵清晰, 且随靶DNA 分子浓度降低, 信号结果呈现减弱趋势变化, 差异较明显(图5).图5 荧光纳米金探针检测不同浓度核酸的芯片扫描结果图 Figure 5 Results of detected DNA with fluorescent gold nanoparticle probes(a) 10－8 mol/L; (b) 10－9 mol/L; (c) 10－10mol/L; (d) 10－11mol/L; (e) 10－12mol/L; (f) 0 mol/L目前, 基于纳米金探针结合基因芯片银染的检测方法已有报道[23,24]. 通过将待测DNA 分子与纳米金探针置于芯片上杂交, 杂交后清洗芯片并晾干, 而后银染并检测银染信号来判断靶DNA 的存在. 用图5荧光检测后的基因芯片进行银染, 以比较荧光检测法与银染检测法的灵敏度, 如图3c 所示, 纳米金探针-银染方法虽然通过银染得到可目视化结果, 无需仪器测量, 但其检测过程对纳米金探针和待检测核酸的要求量都很高, 其检测灵敏度为浓度0.1 nmol/L 的核酸分子(图6).图 6 纳米金探针-银染方法检测不同浓度靶核酸的芯片扫描结果图Figure 6 Results of detected DNA with gold nanoparticle probes and silver staining(a) 10－8 mol/L; (b) 10－9 mol/L; (c) 10－10mol/L; (d) 10－11mol/L; (e) 10－12mol/L; (f) 0 mol/L上述结果比较可知, 基于纳米金探针芯片银染方法和荧光探针直接检测方法的灵敏度(检测靶核酸的最低浓度分别为0.1, 1 nmol/L)均低于本文荧光纳米金探针结合基因芯片检测方法的灵敏度(检测靶核酸的最低浓度为1 pmol/L). 由此可见, 本文方法在检测过程中运用荧光标记的纳米金探针使检测信号得到放大, 核酸检测具有更高的灵敏度.纳米金颗粒表面按照一定比例标记有检测探针和荧光信号探针, 两种DNA 探针具有不同作用: 检测探针与已结合到芯片表面的靶核酸结合, 同时将纳米金(带有荧光信号探针)也结合于芯片表面; 检测过程中检测信号探针上的荧光信号. 当纳米金表面检测探针和信号探针比例为1∶5时, 芯片表面结合一个检测探针, 同时可结合至少5个信号探针, 因而荧光纳米金探针对检测起到信号放大作用. 由此可知, 结合于芯片表面(靶核酸)的检测探针量越多, 荧光信号探针量将越多, 被检测到的信号会越强, 核酸检测的灵敏度越高.目前, 纳米金颗粒表面检测探针和荧光信号探针的比例较小(1∶5), 即标记的荧光信号探针数量相对较少, 检测到荧光信号探针的量较少, 但仍可检测低至 1 pmol/L 的靶核酸, 检测灵敏度高于直接运用荧光探针检测(可检测浓度为1 nmol/L 的靶核酸), 说明纳米金颗粒表面该比例探针的确对检测起到信号放大作用. 因此,2148化学学报V ol. 67, 2009在纳米金探针制备过程中, 将纳米金表面检测探针和荧光信号探针的标记比例提高到1∶30, 1∶60或1∶100等, 即增大荧光信号探针在纳米金表面所占比例, 该荧光纳米金探针的信号放大作用会增强, 运用此纳米金探针进行核酸检测的灵敏度将会得到进一步提高. 但是, 随纳米金颗粒表面荧光信号探针量的增加, 与靶DNA 互补配对的检测探针量将减少, 加之受空间位阻的影响, 杂交效率会降低[7], 因此需要对杂交条件、纳米金探针的标记等方面进一步优化, 可得到较高的检测灵敏度.综上所述, 本文所提出的运用荧光纳米金探针结合基因芯片的核酸检测新方法有如下优点: 节约核酸探针的用量, 影响因素少, 杂交反应的非特异性小; 用荧光分子标记的信号探针检测信号, 相对银染检测信号, 操作简单, 灵敏度更高; 以纳米金为载体, 通过标记一定比例的检测探针和荧光信号探针构成荧光纳米金探针, 不仅有利于杂交反应, 而且对检测起信号放大作用. 因此, 本文阐述的DNA检测方法将具有更广阔的应用前景.3 结论本文提出的纳米金结合基因芯片的新方法, 是根据纳米材料的特性, 在运用纳米材料的基础上, 将纳米技术和基因芯片技术结合而建立起来的一种新的核酸检测方法. 通过检测实验, 初步确定当纳米金的检测探针和信号探针比例为1∶5时, 该方法的检测灵敏度为 1 pmol/L(靶核酸浓度), 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可以进一步提高核酸检测的灵敏度, 这种检测方法在核酸检测中将有较高的应用价值.References1 Yang, H.-W.; Liu, J.-L.; Yang, Y.; Chen, J.-S.; Jin, Q.-W.;Yang, N.-W. Chin. J. Cancer Prev. Treat. 2008, 15, 659 (in Chinese).(杨华伟, 刘剑仑, 阳扬, 陈建思, 金钦文, 杨南武, 中华肿瘤防治杂志, 2008, 15, 659.)2 Lu, W.-P.; Gu, D.-Y.; Wang, H.; An, L. Biotechnology Bul-letin2008, (3), 95 (in Chinese).(鲁卫平, 顾大勇, 王华, 安琳, 周元国, 生物技术通报, 2008, (3), 95.)3 Call, D. R.; Borucki, M. K.; Loge, F. J. J. Microbiol. Meth-ods2003, 53, 235.4 Fu, P.; Yuan, R.; Chai, Y.-Q.; Yin, B.; Cao, S.-R.; Chen,S.-H.; Li, W.-Y. Acta Chim. Sinica2008, 66, 1796 (in Chi-nese).(付萍, 袁若, 柴雅琴, 殷冰, 曹淑瑞, 陈时洪, 李宛洋, 化学学报, 2008, 66, 1796.)5 Wolfgang, F.; Andrea, C.; Robert, M. Proc. SPIE2002,4626, 17.6 Zhou, Z.; Zhu, D.-B.; Xing, D. Acta Chim. Sinica2006, 64,1279 (in Chinese).(周政, 朱德斌, 邢达, 化学学报, 2006, 64, 1279.)7 Nam, J.-M.; Stoeva, S. I.; Mirkin, C. A. J. Am. Chem. Soc.2004, 126, 5932.8 Thaxton, C. S.; Georganopoulou, D. G.; Mirkin, C. A. Clin.Chim. Acta2006, 363, 120.9 Xi, D.; Ning, Q.; Lu, Q.-H.; Yao, K.-L.; Liu, Z.-L.; Luo,X.-P. J. Nanopart. Res. 2008, 10, 393.10 Qin, W. J.; Yue, L.; Yung, L. Y. Nucleic Acids Res.2007,35, e111.11 Sato, K.; Hosokawa, K.; Maeda, M. Anal. Sci.2007, 23, 17.12 Mo, Z.-H.; Guo, K.-P.; Yang, X.-C. Chin. J. Anal. Chem.2008, 36, 518 (in Chinese).(莫志宏, 郭昆鹏, 杨小超, 分析化学, 2008, 36, 518.)13 Baptista, P.; Pereira, E.; Eaton, P.; Doria, G.; Miranda, A.;Gomes, I.; Quaresma, P.; Franco, R. Anal. Bioanal. Chem.2008, 391, 943.14 Mo, Z.-H.; Yang, X.-C.; Guo, K.-P.; Wen, Z.-Y. Anal. Bio-anal. Chem. 2007, 389, 493.15 Wang, H.; Zhang, C.-X.; Li, Y.; Qi, H.-L. Anal. Chim. Acta2006, 575, 205.16 Zhu, N. N.; Chang, Z.; He, P. G.; Fang, Y. Z. Anal. Chim.Acta2005, 45, 21.17 Chang, Z.; Zhu, N.-N.; Zhao, K.; Fan, H.; He, P.-G.; Fang,Y. Z. Acta Chim. Sinica2007, 65, 135 (in Chinese).(常竹, 祝宁宁, 赵琨, 樊浩, 何品刚, 方禹之, 化学学报, 2007, 65, 135.)18 Zhu, D.; Tang, Y.; Xing, D.; Chen, W. R. Anal. Chem.2008, 80, 3566.19 Liu, G. D.; Lin, Y. H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 10394.20 Partridge, M.; Li, S.-R.; Pateromichelakis, S.; Langdon, J.D. Clin. Cancer Res. 2000, 6, 2718.21 Li, X.-Y.; Yang, Z.-L.; Zhou, H.-G. J. Zhangzhou Teach.Coll. (Nat. Sci.) 2004, 17, 31 (in Chinese).(李秀燕, 杨志林, 周海光, 漳州师范学院学报(自然科学版), 2004, 17, 31.)22 Sun, Y. G.; Xia, Y. N. Science2002, 298, 2176.23 Taton, T. A.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Science2000,289, 1757.24 Park, S. J.; Taton, T. A.; Mirkin, C. A. Science2002, 295,1503.(A0811263 Qin, X.; Zheng, G.)。

DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.00258基于酪胺信号放大的新型免疫传感器刘梦琴*1 蒋健晖2 冯泳兰1 黄勇2 沈国励2 俞汝勤21(衡阳师范学院化学与材料科学系功能金属有机材料湖南省重点实验室,衡阳421008)2(湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室,长沙410082)摘 要 将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。

利用纳米金的静电吸咐和己二硫醇、巯基乙胺的自组装,将羊抗人Ig G 抗体固定到金电极表面上,以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG 抗体为酶标抗体,以生物素化酪胺为酶底物,利用催化酪胺沉积反应,在传感界面沉积大量生物素,使原始信号得到几何级数的放大。

结果表明,通过生物素化酪胺催化放大后,制得的免疫传感器对H 2O 2的催化能力增大近20倍,检测hIgG 在1.5 g /L ~22m g /L 范围内有良好的线性关系,检出限为0.1 g /L 。

用于实际试样的回收率的测定,结果良好。

关键词 电化学酶联免疫传感器;信号放大;酪胺氧化沉积;生物素;纳米金2009 06 22收稿;2009 10 08接受本文系国家自然科学基金项目(No .20205005)、新世纪优秀人才支持计划基金(N o .NCET 04 0768)、湖南省重点学科建设项目和湖南省教育厅科研计划项目(N o .07C162)资助*E m ai:l li um engqi n2004@yahoo .co 1 引 言酶联免疫分析法是将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的专一性、特异性相结合,以酶标记的抗原或抗体为主要试剂的免疫测试方法,具有很高的灵敏度和选择性[1~4]。

近年来,关于信号放大酶联免疫传感器的研究多采用安培型或伏安型免疫传感器[5~7]。

本研究将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。

酪胺,又名对羟基苯乙胺,是一类含氮低分子的生物胺,对动植物和微生物有重要的生理作用,具有易发生氧化的特性[8,9]。

DNA功能化的金纳米粒子1 DNA功能化的金纳米粒子及其应用用DNA分子修饰无机纳米粒子为其在传感，药物和基因传输，光学和能源领域的应用带来了新的机遇。

同时利用DNA对纳米颗粒间相互作用的控制，基于DNA的平台也能为构建复杂纳米粒子组装结构提供灵活性和多样性。

DNA金纳米粒子复合物(DNA-AuNPs)是一种纳米生物复合物，由内层的纳米粒子和外层的DNA组成，起到了连接生物体系和纳米材料的作用。

上世纪九十年代中期，Mirkin研究组和Alivisatos研究组在他们的开创性工作中，首次报道了DNA功能化的金纳米粒子体系。

Mirkin等人合成了13 nm的金纳米粒子(在溶液中呈现均一的红色，紫外吸收峰波长为520 nm)，然后将末端为巯基修饰的DNA通过S-Au化学键相互作用固定到金纳米粒子表面得到DNA．金纳米粒子复合物(图1．9)，后来他们将这种复合物重新命名为球形核酸(spherical nucleic acid，SNA)。

由于这种DNA修饰的金纳米粒子复合物既具有金纳米粒子的光学和物理化学特性，又具有DNA分子的可编程特性和生物特性，自从Mirkin等人的开创性工作发表以来，DNA功能化的金纳米粒子发展应用迅速，已经被广泛应用于生物传感，离子检测，核酸比色检测，金纳米粒子结晶组装，生物成像等领域。

图1．9 Spherical nucleic acid(SNA) conjugates.1.1 DNA功能化的金纳米粒子在核酸检测中的应用基因突变的检测可以为诊断提供重要的目树，使人们对用于包括癌症在内的许多疾病早期诊断的核酸检测越来越感兴趣。

荧光和放射性检测读出方法(如PCR，PT-PCR，分子印迹法，以及高密度微阵列法等)是传统的核酸检测方法。

金纳米粒子比色法已经被证明是核酸目标链检测方面的一种极具竞争力的检测技术。

在金纳米粒子比色法中，待检测目标物直接或者间接的引发金纳米粒子聚集，并且导致金纳米粒子的吸收波长在可见光区域内发生红移。

基于DNA电化学发光传感器研究金纳米颗粒对量子点的电化学发光影响鲁理平;李娇;武静;康天放;程水源【摘要】纳米金颗粒具有高的消光系数和良好的表面等离子体共振特性，其等离子体共振特性受纳米金颗粒的尺寸和周围环境等因素的影响。

本文基于半导体纳米晶电化学发光信号对金纳米颗粒的距离依赖性制备了DNA电化学发光传感器。

首先利用循环伏安法(CV)在玻碳电极(GCE)表面原位沉积金纳米颗粒(AuNPs)，巯基丙酸包裹的CdS量子点(QDs)与氨基修饰的双链DNA (dsDNA)通过酰胺键缩合，形成量子点修饰的双链DNA (QDs-dsDNA)。

最后将QDs-dsDNA通过dsDNA 另一端的巯基组装到纳米金表面，得到CdS QDs-DNA/AuNPs/GCE电化学发光传感器。

在优化电极表面QDs-dsDNA密度、金纳米颗粒沉积方法等实验条件的基础上，对不同传感器的表面性质进行了表征，如形貌和电化学阻抗等。

进一步通过控制纳米金和CdS QDs之间的DNA研究了纳米金对CdS QDs发光信号的影响作用。

结果显示DNA链的长度和类型对发光信号有着重要的影响。

最后将此传感器用于环境污染物的DNA损伤检测，显示出很好的灵敏响应。

%Gold nanoparticles (AuNPs) have a high extinction coefficient and a strong surface plasmon resonance, the latter of which is influenced by the size of AuNPs and the surrounding environment. In this article, a DNA electrochemiluminescence (ECL) sensor was fabricated based on the distance-dependence of semiconductor nanocrystals' ECL signal to AuNPs. AuNPs were first deposited on the surface of glassy carbon electrode (GCE) by cyclic voltammetry (CV). The mercaptopropionic acid-capped CdS quantum dots (QDs) used in this study can covalently bind with amino-terminated double-stranded DNA (dsDNA), via the―CO―NH bond to obtain a QDs-dsDNA compound. The QDs-dsDNA compounds were assembled on the surface of AuNPs via an Au―S bond, using th e other distal of dsDNA that is labeled with thiol, to create the CdS QDs-DNA/AuNPs/GCE ECL sensor. Experimental conditions, such as the QDs-dsDNA density on the surface of electrode and the deposition method of AuNPs, were then optimized. The surface properties of different modified electrodes were characterized by scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The effect of AuNPs on the ECL intensity of CdS QDs was investigated by control ing the DNA which lies between the AuNPs and the CdS QDs. The ECL signal was affected significantly by the length and type of DNA strands. The sensor was used to detect DNA damage from environmental pol utants and exhibited a highly sensitive response.【期刊名称】《物理化学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P483-488)【关键词】量子点;电化学发光;金纳米颗粒;DNA;全氟辛酸【作者】鲁理平;李娇;武静;康天放;程水源【作者单位】北京工业大学环境与能源工程学院，区域大气复合污染防治北京市重点实验室，北京100124;北京工业大学环境与能源工程学院，区域大气复合污染防治北京市重点实验室，北京100124;北京工业大学环境与能源工程学院，区域大气复合污染防治北京市重点实验室，北京100124;北京工业大学环境与能源工程学院，区域大气复合污染防治北京市重点实验室，北京100124;北京工业大学环境与能源工程学院，区域大气复合污染防治北京市重点实验室，北京100124【正文语种】中文【中图分类】O646贵金属纳米颗粒是纳米材料的一个重要分支.随着纳米科学的发展,金纳米颗粒(AuNPs)以其优良的稳定性、良好的生物亲和性以及易于制备等优点,使其在传感器研制、电催化等领域都得到了广泛的关注.1-5近年来,半导体纳米晶-量子点(QDs)与纳米贵金属表面的相互作用特性引起了人们的研究兴趣,该体系即金属表面的等离子体对半导体纳米晶发光特性的影响作用.研究表明,金、银等纳米金属表面等离子体能显著影响与之临近的半导体纳米晶的发光强度,等离子体共振诱导的发光增强或福斯特共振能量转移导致的发光淬灭.6-9电化学发光方法是电化学和化学发光的结合,它不仅具有化学发光分析灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点,而且还具有电化学分析控制性强、选择性好等优点.10-12在电化学发光的研究中,通过化学修饰的方法直接或间接将参与化学发光反应的试剂固定在电极上,对电化学发光位点的控制容易实现,从而有利于提高灵敏度,增强选择性,且便于多元分析物测定及成像分析.13自2002年Bard课题组14首次于Science杂志上报道了硅量子点(Si QDs)在有机溶液中的电化学发光特性以来,量子点作为新兴的电化学发光体引起了研究者的极大兴趣.15,16为了更好地理解金属表面等离子体对半导体纳米晶的电化学发光作用及其应用,我们构建了QDs-DNA/AuNPs/GCE(玻碳电极)电化学发光传感界面,分别选用了不同链长DNA和不同类型DNA来实现对QDs与纳米金体系的调控,探讨了纳米金对QDs发光信号的影响,并基于此测定了环境污染物导致的DNA损伤.CHI 660e型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);光电倍增管(H9306-03,日本滨松),电阻值调节为1000 Ω;漩涡振荡器(北京鼎国昌盛有限公司); KQ218超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); Pico Scan-MI型原子力显微镜(AFM,美国);JEOL JSM 6500F型扫描电子显微镜(SEM,日本).电化学方法采用三电极系统:修饰的玻碳电极(d=3 mm)为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝为对电极.2.2 实验试剂全氟辛酸(PFOA,≥96%)、巯基丙酸(MPA,≥99%)、氯金酸(HAuCl4,≥49%)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC,≥99%)和6-巯基己-1-醇(MCH,≥97%),购自Sigma公司(USA);柠檬酸三钠(≥99%)、五水合氯化镉(CdCl2·5H2O,≥99%)和过硫酸钾(K2S2O8,≥99.5%),购于北京化学试剂有限公司;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,≥99%)和硫代乙酰胺(≥99%),购于国药集团化学试剂有限公司;氯化镁(MgCl2,≥99%)购于上海生工生物有限公司;所有试剂均为分析纯,实验用水为超纯水.DNA溶液的储备液用5 mmol·L-1磷酸缓冲溶液PBS(NaH2PO4,Na2HPO4,KCl,pH 7.0)配制.所有DNA均由北京赛百盛生物技术有限公司合成纯化.杂交双链DNA所需的单链DNA(ssDNA)序列(5'to 3')如下:实验中所需的单链ssDNA的序列(5'to 3')如下:ssDNA-7:5'-SH GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG NH2-3' 由ssDNA-1和ssDNA-2杂交而成的互补双链DNA记为dsDNA;由ssDNA-1和ssDNA-3杂交而成的单碱基误配双链DNA记为MMdsDNA-1;由ssDNA-1和ssDNA-4杂交而成的双碱基误配双链DNA记为MMdsDNA-2(误配碱基对均为AC误配);由15个碱基的短链ssDNA-5和ssDNA-6杂交而成的短链互补双链DNA记为dsDNA-15.2.3.1 CdS QDs的制备CdS QDs的合成方法参考文献,17可简单描述为:将20 mL 20 mmol·L-1CdCl2溶液和86µL巯基丙酸混合,用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH至10,将溶液转移到三口烧瓶中,在通氮气、磁力搅拌的条件下加入20 mL 20 mmol·L-1硫代乙酰胺溶液,80°C冷凝回流4 h,自然冷却至室温后,置于离心机中4000 r·min-1离心10 min,弃去沉淀物,保留上清液, 4°C冰箱保存.其形貌通过透射电镜和紫外光谱表征(图略),得到粒径大小为2-3 nm的样品.2.3.2 QDs-dsDNA复合物的制备取一定量CdS QDs溶液,加入适量的0.1 mol· L-1的EDC和0.1 mol·L-1的NHS(体积比为2:1),震荡5 min,再加入适量的dsDNA溶液,震荡反应30 min,并用NAP-5柱纯化,得到量子点修饰的双链DNA(QDs-dsDNA).2.3.3 DNA电化学发光传感器的制备玻碳电极(GCE)使用前,在抛光机上用粒径为0.05µm Al2O3粉浊液抛光至镜面,依次用无水乙醇、超纯水超声清洗5 min,用氩气吹干备用.将表面清洗干净的玻碳电极浸入含0.5 mol·L-1H2SO4的5 mmol·L-1HAuCl4溶液中沉积纳米金,电位范围为0-1.0 V,速率为50 mV·s-1,沉积圈数为5圈,此电极记为AuNPs/GCE,用超纯水冲洗干净,氩气吹干.取适量QDs-dsDNA溶液滴加至AuNPs/GCE表面,湿润环境下自组装16-24 h.将MCH溶液滴加至电极表面,室温组装1 h,封闭电极表面,并用0.1 mol·L-1PBS充分清洗,此电极记为QDs-dsDNA/AuNPs/ GCE,制备过程如图1所示.2.3.4 PFOA损伤将QDs-dsDNA/AuNPs/GCE浸泡在一定浓度的PFOA溶液中,37°C条件下温浴30 min,用0.1 mol· L-1的PBS(pH=7.4)充分冲洗.2.3.5 电化学发光检测将电极置于0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)+0.1 mol· L-1K2S2O8溶液中,以铂丝为对电极,以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极进行循环伏安扫描,并用光电倍增管(PMT)收集光信号,PMT的电阻设置为1000 Ω,电位扫描范围为0--2.0 V,扫描速率为100 mV·s-1.3.1 修饰电极的界面表征3.1.1 扫描电子显微镜和原子力显微镜表征图2(左)为玻碳电极沉积纳米金的扫描电子显微镜(SEM)图,从图中可以看出,金纳米颗粒均匀地分布在玻碳电极表面.QDs-dsDNA/AuNPs/GCE的原子力显微镜(AFM)(图2(右))表征了QDs-dsDNA在电极表面的状态.从图中可以看出,QDs-dsDNA呈颗粒状态,紧密、均匀地分布在表面.量子点修饰的dsDNA被组装到电极表面的原理是dsDNA的两端分别修饰巯基(—SH)和氨基(—NH2),修饰—NH2的一端与QDs以酰胺键连接,修饰—SH的一端通过Au—S键共价键合在AuNPs表面.3.1.2 电化学阻抗表征电化学阻抗谱(EIS)是表征修饰电极表面特征的有效手段.18一般情况下,电极的阻抗图是由受扩散控制的低频段和受动力学控制的高频段两部分组成的,高频部分的半圆形曲线的直径等于电子转移阻抗.图3为不同修饰电极在5 mmol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1:1)+0.1 mol·L-1KCl溶液中的电化学阻抗谱图.由图可知,当玻碳电极修饰上纳米金后,高频段没有显示电子转移阻抗的半圆形曲线,只观察到受扩散控制的低频段曲线,这是因为纳米金颗粒优良的电子传递性能.19而量子点修饰的双链DNA(QDs-dsDNA)组装到纳米金颗粒表面后,电子转移电阻明显增大了,这是由于DNA的磷酸骨架带负电荷,排斥[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-到达电极表面,而且QDs为半导体,20从而增大了电子在电极表面转移的阻力,21同时也证明QDs-dsDNA组装到金的表面.最后经PFOA损伤后的传感器(QDsdsDNA/AuNPs/GCE)电化学阻抗明显增大,其原因可推测为PFOA与DNA 发生作用,导致了DNA碱基完美堆积结构的破坏,22消弱了DNA的电荷传递,增大了界面阻抗.3.2 电极表面QDs-dsDNA密度的影响将DNA组装到界面时,通常会加入MgCl2来中和DNA磷酸骨架的负电荷,减小DNA之间的相互排斥作用,从而使DNA能均匀、紧密地连接在电极表面,提高DNA固载量,增大信号强度.为了确定QDs-dsDNA组装在AuNPs/GCE表面的密度大小对组装效果的影响,我们比较了dsDNA溶液中是否加入MgCl2对电化学发光强度的影响.实验结果如图4所示,dsDNA溶液中不加MgCl2时,QDs-dsDNA/ AuNPs/GCE的电化学发光强度要明显大于加入MgCl2的情况.这是由于在本体系中,QDs-dsDNA是连接在近似球形的金纳米颗粒上,连接在金纳米颗粒顶端的QDs-dsDNA可以直立在金表面,而对于固载在球形边缘的QDs-dsDNA将无法直立于电极表面,23所以会导致部分QDs与金纳米颗粒接触,从而发生能量转移使得发光淬灭.因此本实验所用DNA溶液中不加MgCl2.3.3 纳米金对量子点电化学发光作用的影响3.3.1 纳米金对发光信号的增强作用图5为不同修饰电极在0.1 mol·L-1PBS(pH= 7.4)+0.1 mol·L-1K2S2O8溶液中的电化学发光图.其中曲线a为QDs-dsDNA/AuNPs/GCE的电化学发光图,曲线b 为QDs-dsDNA/Au电极(即直接将QDsdsDNA组装在金盘电极上)的电化学发光图.由图可以看出,QDs-dsDNA/AuNPs/GCE的发光强度明显大于QDs-dsDNA/Au电极.这是由于在电化学发光的激发下,纳米金颗粒表面发生表面等离子体共振(SPR),从而增强了量子点的电化学发光强度.3.3.2 纳米金与QDs之间的距离对电化学发光强度的影响利用DNA链的长短来控制纳米金与QDs之间的距离,研究传感器发光强度对距离的依赖性.双螺旋结构的dsDNA的三个碱基长度大约为1 nm,24因此,30个碱基对的dsDNA长度大约为10 nm;15个碱基对的dsDNA长度大约为5 nm.如图6所示,修饰含30个碱基对的dsDNA时,电极的电化学发光强度明显大于修饰含15个碱基对的dsDNA电极.这是由于,在电化学发光的激发下,金纳米颗粒表面会发生表面等离子体共振(SPR),从而导致电化学发光强度的增大.而当金纳米颗粒与量子点的间距较小时,二者之间发生福斯特共振能量转移(FRET),从而导致电化学发光的淬灭.253.3.3 DNA类型对电化学发光强度的影响考察了分别组装单链DNA(ssDNA-7)、单碱基误配(MMdsDNA-1)及双碱基误配(MMdsDNA-2)时产生的电化学发光强度变化.图7分别表示QDsdsDNA/AuNPs/GCE、QDs-MMdsDNA-1/AuNPs/GCE、QDs-MMdsDNA-2/AuNPs/GCE、QDs-ssDNA-7/AuNPs/ AuNPs/GCE的电化学发光曲线.由图中可以看出, QDs-ssDNA-7/AuNPs/GCE(d)的电化学发光强度远小于QDs-dsDNA/AuNPs/GCE(a).其原因是单链DNA无法直立于纳米金表面,倾倒的DNA链将导致QDs与纳米金临近或接触,从而发生能量转移,发光淬灭.碱基误配MMdsDNA修饰电极的发光强度明显小于完全互补dsDNA电极的电化学发光强度,其中双碱基误配MMdsDNA-2修饰电极的发光信号要稍小于单碱基误配MMdsDNA-1,误配碱基对均为C-A.其原因是碱基误配DNA的碱基堆集刚性结构受到破坏,DNA以一定的倾斜度直立于金表面,使QDs与纳米金的距离缩短,部分导致发光淬灭;另一原因是碱基误配削弱了DNA的电荷传递使QDs电化学发光强度减弱.3.4 PFOA对DNA的损伤测定图8为QDs-dsDNA/AuNPs/GCE在PFOA中浸泡前后的电化学发光图,曲线a为QDs-dsDNA/ AuNPs/GCE的电化学发光图,曲线b为PFOA损伤后PFOA/QDs-dsDNA/AuNPs/GCE的电化学发光图.由实验结果可知,经PFOA损伤后,电极的电化学发光强度较未损伤的有显著的减小,其原因可以推测是由于PFOA与dsDNA 结合,破坏了DNA碱基紧密堆集的刚性结构,导致QDs与纳米金的距离缩短,从而发生了能量转移,使得电极的发光强度显著减小.在构建QDs-DNA/AuNPs/GCE电化学发光传感界面的基础上探讨了金纳米颗粒对量子点电化学发光强度的影响.通过DNA链的长短实现对QDs与纳米金之间距离的控制,测定了二者之间的距离对发光强度的影响.同时采用SEM、AFM对修饰电极进行了表征,通过电化学及组装不同类型DNA进行了讨论.结果表明,纳米金对QD是的发光强度的作用依赖于其与QDs之间的距离,且发现该体系可用来测定PFOA对DNA的损伤.(1)Dulkeith,E.;Morteani,A.C.;Niedereichholz,T.;Klar,T.A.;Feldmann,J.;Levi,S.A.;Reinhoudt,D.N.;Moller,M.;Gittins,D.I.Phys.Rev.Lett.2002,89(20),203002.doi:10.1103/ PhysRevLett.89.203002(2)Du,H.;Disney,M.D.;Miller,B.L.;Krauss,T.D.J.Am.Chem.Soc.2003,125(14),4012.doi:10.1021/ja0290781(3)Han,R.C.;Yu,M.;Sha,Y.L.Acta Phys.-Chim.Sin.2011,27 (1),255.[韩荣成,喻敏,沙印林.物理化学学报,2011,27 (1),255.]doi:10.3866/PKU.WHXB20110135 (4)Lu,L.P.;Wang,S.Q.;Lin,X.Q.Anal.Chim.Acta2004,519(2),161.doi:10.1016/j.aca.2004.05.062(5)Lu,L.P.;Xu,L.H.;Kang,T.F.;Cheng,S.Y.Appl.Surf.Sci.2013,284(1),258.doi:10.10 16/j.apsusc.2013.07.091(6)Liebermann,T.;Knoll,W.Colloid Surf.A-Physicochem.Eng. Asp.2000,171(1-3),115.doi:10.1016/S0927-7757(99)00550-6(7)Matsuda,K.;Kanemitsu,Y.Appl.Phys.Lett.2008,92(21),211911.doi:10.1063/1.2937142(8)Sen,T.;Patra,A.J.Phys.Chem.2012,116(33),17307.doi: 10.1021/jp302615d(9)Yang,F.;Wang,L.L.;Guo,Z.H.Acta Chim.Sin.2012,70(11), 1283. [杨帆,王伶俐,郭志慧.化学学报,2012,70(11), 1283.]doi:10.6023/A1201124(10)Li,H.J.;Han,S.;Hu,L.Z.;Xu,G.B.Chin.J.Anal.Chem.2009,37(11),1557.[李海娟,韩双,胡连哲,徐国宝.分析化学,2009,37(11),1557.]doi:10.1016/S1872-2040(08)60139-5(11)Guo,Z.H.;Tang,L.J.;Zhang,Z.J.Chin.J.Anal.Chem.2009,37(1),13. [郭志慧,唐隆键,章竹君.分析化学,2009,37(1), 13.]doi:10.1016/S1872-2040(08)60078-X (12)Gao,W.H.;Zhang,A.;Chen,Y.S.;Chen,Z.X.;Chen,Y.W.;Lu,F.S.;Chen,Z.G.Biosens.Bioelectron.2013,49,139.doi:10.1016/j.bios.2013.05.013(13)Jiang,H.;Wang,mun.2009,11(6),1207.doi:10.1016/j.Elecom.2009.04.004(14)Ding,Z.F.;Quinn,B.M.;Haram,S.K.;Pell,L.E.;Korgel,B.A.;Bard,A.J.Science2002,296(5571),1293.doi:10.1126/ science.1069336(15)Lu,L.P.;Xu,L.H.;Kang,T.F.;Cheng,S.Y.Chin.J.Anal. Chem.2013,41(6),805.[鲁理平,许来慧,康天放,程水源.分析化学,2013,41(6),805.]doi:10.1016/S1872-2040(13) 60659-3(16)Wu,J.;Lu,L.P.;Kang,T.F.;Cheng,S.Y.Journal of InstrumentalAnalysis2014,33(4),367.(17)Wang,H.Y.;Zhang,X.L.;Tan,Z.A.;Yao,W.;Wang,L.mun.2008,10(1),170.doi:10.1016/j. elecom.2007.11.015(18)Ren,X.M.;Pickup,P.G.J.Electroanal.Chem.1997,420(1-2),251.doi:10.1016/S0022-0728(96)04784-5(19)Wang,J.;Han,H.Y.;Jiang,X.C.;Huang,L.;Chen,L.N.;Li,N.Anal.Chem.2012,84(11),4893.doi:10.1021/ac300498v(20)Morteza,H.;Mohammad,R.G.;Zahra,V.;Farnoush,F.;Batool,A.;Mohammad,H.S.Spectrochim.Acta A2014,121,116.doi:10.1016/j.saa.2013.10.074(21)Lu,L.P.;Xu,L.H.;Kang,T.F.;Cheng,S.Y.Biosens.Bioelectron.2012,35(1),180.doi:10.1016/j.bios.2012.02.043(22)Lu,L.P.;Xu,L.H.;Kang,T.F.;Cheng,S.Y.Applied SurfaceScience2013,284,258.doi:10.1016/j.apsusc.2013.07.091(23)Kelley,S.O.;Barton,J.K.Science1999,283(5400),375.doi:10.1126/science.283.5400.375(24)Wang,J.;Shan,Y.;Zhao,W.W.;Xu,J.J.;Chen,H.Y.Anal.Chem.2011,83(11),4004.doi:10.1021/ac200616g(25)Amouyal,E.;Homsi,A.;Chambron,J.C.;Sauvage,J.P. J.Chem.Soc.Dalton Trans.1990,6(6),1841.doi:10.1039/ dt9900001841。

2022年第10期广东化工第49卷总第468期 · 85 ·纳米载药系统的研究进展卓新雨1，张艾立2，马菲1，崔志磊3，刘臻2*，谢恬2(1．杭州师范大学基础医学院，浙江杭州311121；2．杭州师范大学药学院，浙江杭州311121；3．上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科，上海200092)[摘要]纳米载药系统是指由无机或高分子材料形成的纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。

纳米载药系统具有改善药物性能、增强药物靶向性、提高生物利用度、降低药物毒副作用等优势，正成为新型给药系统的研究热点，至今已经开发了纳米颗粒、纳米脂质体、纳米胶束及纳米乳液等。

本文对纳米载药系统近10年来的发展状况做如下整理和分析，以供后续研究者和临床工作者参考。

[关键词]纳米材料；载药系统；靶向性；低毒性；制备方法[中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2022)10-0085-03Research Progress of Nanometer Drug Delivery SystemZhuo Xinyu1, Zhang Aili2, Ma Fei1, Cui Zhilei3, Liu Zhen2*, Xie Tian2(1. School of Basic Medical Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121；2. College of Pharmacy, School of Medicine, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121；3. Department of Respiratory Medicine, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai JiaoTong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)Abstract: Drug-loading nanoparticles drug delivery system refers to the drugs and materials together to form the nano-scale microscopic category of particulate drug carrier conveying system, as a new research hot spot in drug delivery system, improve the drug absorption, drug targeting, improve bioavailability, reduce the side effects of drugs, the improvement of drug circulation and the advantages of the distribution in the body, nano-particles, nano-liposomes, nano-micelles, nano-emulsions and suspensions have been developed. In this paper, the development of nano-drug delivery system in the past 10 years is summarized and analyzed as follows for the reference of subsequent researchers and clinical workers.Keywords: nano materials；drug delivery system；targeting；low toxicity；preparation methods1 引言药物载体是通过改变药物剂型来达到药物能够高效的进入人体，改善药物的血药浓度，并控制药物释放速度，或将药物靶向的输送到人体某一部位。

几种常用的纳米材料在电化学生物传感器中的应用姚惠琴;黄珊;甘倩倩【摘要】基于纳米材料独特的物理和化学性质,使其构建的电化学生物传感器在线性范围、检测限、响应时间等方面均表现出良好的性能,已成为发展新型电化学生物传感器的研究热点.该文主要介绍了几种常用的纳米材料如碳纳米管、石墨烯、金纳米在电化学生物传感器中的应用,并对其应用前景进行了展望.【期刊名称】《化学传感器》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】7页(P10-16)【关键词】纳米材料;生物传感器;应用【作者】姚惠琴;黄珊;甘倩倩【作者单位】宁夏医科大学药学院,宁夏银川750004;宁夏医科大学药学院,宁夏银川750004;宁夏医科大学药学院,宁夏银川750004【正文语种】中文纳米材料是指其在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1～100 nm）或由它们作为基本结构单元所构成的材料，正是由于这一尺寸的特殊，使得其具有优异的物理化学特性、量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。

自从1984年被德国的物理学家Gleiter［1］发现，研究者们就对其产生了浓厚的兴趣，目前纳米材料已经深入到各个不同的科学领域，并成为近年来科学界的研究热点。

纳米材料除了拥有特殊的五种基本功能特性外，还具有非常特殊的化学反应性质、光电性质、催化性质、光电化学性质、特殊的物理机械性质和化学反应动力学性质［2］。

用纳米材料制成的电化学生物传感器有许多优异的性能，例如检测灵敏度更高、体积更小和可靠性更好等。

一些纳米材料如铂纳米粒子、石墨烯、金纳米粒子、钯纳米粒子被证实对于特定的底物有良好的催化活性，将这些纳米粒子作为传感器的固载物质或者标记物在提高生物传感器的响应性能方面有很大的帮助［3］。

纳米材料这些特殊的性质使其在电化学生物传感器的构建和发展中占据非常重要的地位。

该文将对纳米材料及电化学生物传感器进行概述，并介绍几种常见的纳米材料及其在电化学生物传感器中的应用。

2009年第54卷第4期:430~435《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS 论文自组装制备Fe3O4@Au复合纳米粒子用于固定化葡萄糖氧化酶王显祥①②*, 黄硕①, 单志①, 杨婉身①*①四川农业大学生命科学与理学院, 雅安 625014;②四川大学化学学院, 成都 610041*联系人, E-mail: wansheny@; xianxiangwang@2008-08-25收稿, 2009-01-01接受四川省教育厅自然科学科研重点项目(批准号: 2005A033)和四川农业大学引进人才基金(批准号: 007202)资助Wang X X, Huang S, Shan Z, et al. Preparation of Fe3O4@Au nano-composites by self-assembly technique for immobilization of glucose oxidase. Chinese Science Bulletin, 2009, 54(7): 1176—1181, doi: 10.1007/s11434-009-0113-7摘要用化学共沉淀法合成了6~12 nm的超顺磁性Fe3O4纳米晶体, 在室温下用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对其表面氨基化, 然后加入Frens法合成的金溶胶, 自组装制备了磁性Fe3O4@Au复合纳米粒子. 用透射电子显微镜(TEM)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、震动样品磁场计(VSM)等方法对合成的金磁微粒的表面形貌、光学、结构、磁性质等进行表征. 结果表明, 合成的金磁微粒粒径分布均匀, 在15~20 nm, 磁响应性好. 金磁微粒有超顺磁性和易与生物分子结合的特点, 以葡萄糖氧化酶(GOx)为模型, 详细研究了固定化酶条件及固定化酶的酶学性质. 固定化酶的最优条件为: Fe3O4:HAuCl4摩尔比为0.5:1, pH 5.5, 温度为28℃. 固定化后葡萄糖氧化酶耐热性提高, 保存时间延长, 且能在外部磁场下分离反复使用. 关键词金磁复合纳米微粒Fe3O4@Au组装固定化酶葡萄糖氧化酶磁性纳米粒子由于具有特殊的磁导向性和优异的生物相容性, 近年来在生物领域的应用研究越来越引起人们的关注[1]. 超顺磁性纳米粒子具有高的磁响应性, 无剩磁, 在磁共振成像(MRI)、癌症和艾滋病等疾病的靶向治疗、生物分离、酶或蛋白质的固定、细胞筛选、核酸纯化以及生物传感器方面都有研究报道[2~6]. 具有好的单分散性以及特定功能性磁性材料一直是人们研究所关注的, 为此, 研究者发展了各种表面修饰的方法, 如在磁性材料表面修饰带特殊功能团的高分子, 如氨基(—NH2)[7], 能和分离的目标结合; 在磁性粒子表面修饰无机金属离子, 如银粒子[8]等, 制备出特殊功能结构的复合纳米磁性粒子. 其中, 由于金纳米粒子具有高的化学稳定性和生物相容性, 而且和有机分子末端的氨基和巯基有好的亲和力[9], 能结合磁性粒子和金粒子的优异特性, 在生物学上有很好的应用前景.一般来说, 合成Fe3O4/Au核壳型磁性复合粒子, 主要是通过种子聚合法[10,11], 或用超声的方法[12]. 即在过量的Fe3O4的种子存在下, 还原HAuCl4, 在磁性粒子表面包覆一层金纳米粒子. 这种方法主要是通过磁性粒子表面的负电荷和金粒子表面的正电荷发生静电吸附成核生长, 复合粒子之间的作用力比较弱; 另外一种方法是通过组装的方法, 用偶联剂连接两种纳米粒子, 通过化学键的相互作用, 得到的复合纳米粒子比较稳定, 不易被外界条件破坏. 磁性微球的氨基化已有报道[7], 且—NH2和胶体金有较强的结合力. 本文首先氨基化磁性粒子, 然后在室温下和胶体金偶联, 自组装制备了金磁复合纳米微粒. 纳米金容易和生物分子中的巯基结合, 选择葡萄糖氧化酶(GOx)为模型, 进行酶的固定化研究, 为构建新型430 图1 自组装制备Fe3O4@Au纳米粒子及固定化葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器奠定实验基础. 整个过程如图1所示.1 实验(ⅰ) 试剂与仪器. FeSO4·7H2O, FeCl3·6H2O, HAuCl4, 柠檬酸三钠等化学试剂均为分析纯, 购自成都科龙化学试剂有限公司; 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES), 葡萄糖氧化酶(酶活>10 U/mg), 辣根过氧化酶(HRP, 酶活>150 U/mg)为Sigma公司提供.傅里叶变换红外光谱仪(Nexus 470, 美国Nicolet 公司), 透射电子显微镜(JEM-2010, 日本电子), 振动样品磁强计(7400, 美国Lake shore公司), 电子恒速搅拌器(RW20DZM.n, 德国IKA公司), 超声波细胞破碎机(JY99-2D, 宁波新芝生物技术股份有限公司).(ⅱ) 水相分散的Fe3O4及金纳米微粒的制备. Fe3O4的制备参照我们课题组单志等[13]的制备方法, 略有改动. 在四颈烧瓶中加入 4 mol/L的NaOH溶液100 mL, 在氮气保护下, 63℃恒温水浴中以150 r/min 的速度搅拌, 30 min后加入56 mL溶解有0.01 mol FeSO4和0.018 mol FeCl3的水溶液, 以300 r/min继续搅拌 1.5 h后停止加热. 然后, 用磁分离架分离并用蒸馏水洗涤至中性后, 放入真空干燥箱干燥备用.金纳米微粒按照经典的Frens[14]报道的方法合成. 盛有0.1% HAuCl4 25 mL的烧瓶, 在97℃水浴中以415 r/min搅拌15 min, 加入10 mL的1%柠檬酸三纳溶液还原, 得到橙红色的浓度约为0.7 g/L的胶体金溶胶, 旋转蒸发掉部分溶液, 定容至10 mL, 得浓度为2.45 g/L的胶体金溶胶备用.(ⅲ) 氨基修饰Fe3O4纳米微粒的表面组装纳米金. 取0.2 g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50 mL 含有20%乙醇水溶液中, 逐滴加入0.4 mL APTES, 室温下搅拌7 h. 反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液, 产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒. 产物用0.1 mol/L HCl乙醇溶液清洗4 h以去除游离未包覆的Fe3O4纳米微粒后, 磁分离清洗6次, 然后用乙醇定容至1 g/L.取25 mL上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒,室温下150 r/min搅拌中迅速加入25 mL的1.8 g/L胶体金溶液, 混合溶液由棕色逐渐变淡, 低速搅拌反应12 h后, 用0.1 mol/L HCl乙醇溶液清洗以除去剩余Fe3O4, 再用水反复磁性分离清洗至中性, 即得摩尔比为M Fe3O4/Au= 0.5:1的金磁复合微粒, 保存在25 mL水溶液中备用. 用同样的方法加入0.9 g/L胶体金溶液, 得摩尔比为M Fe3O4/Au= 1:1的金磁微粒.(ⅳ) 固定化GOx及酶学性能测试. 用0.05 mol/L磷酸缓冲液(根据要求选用pH 5.0~7.0范围内不同的pH)洗涤10 mL金磁性纳米微粒溶液(1 g/L)3次, 用磁分离洗涤后, 加入10 mL 0.1 mg/mL葡萄糖氧化酶酶液, 控温震荡, 磁吸, 弃去上层清液. 然后分别用磷酸缓冲液(0.05 mol/L pH 7.0)及纯水洗涤3次后, 即得固定化葡萄糖氧化酶. 酶活力的测定方法参照姜梅等的方法[15]. GOx酶活力单位(U)定义为: 每分钟氧化1 μmol葡萄糖产生葡萄糖酸和H2O2所需的酶量.配溶液A: 称取3.5 mg辣根过氧化物酶和3.5 mg的4-氨基安替吡啉, 溶于20 mL 0.2 mol/L (pH 7.0)磷酸缓冲液中, 再加入1 mL 3.0%苯酚; 溶液B: 6.5%葡萄糖.取1.5 mL溶液A 和1.5 mL溶液B, 在1 cm比色皿中混合, 加入100 μL溶液酶后, 在25℃, 500 nm处测定其吸光值在15 min内的变化. 将相同的稀释酶液预先加热灭活后做同样的处理作为空白对照. 在上述条件下, 绘制标准曲线. 根据标准曲线, 用同样的方法测定游离酶和固定化酶的酶活力. 考察温度、pH和时间等对酶活力的影响.2 结果与讨论2.1 金磁微粒的表面形貌从实验结果看, 通过化学共沉淀法合成的Fe3O4微粒粒径分布比较均匀,结晶度好,粒径大小在6~12 nm(图1(a)), 达到了超顺磁临界尺寸. 超声分散4312009年2月 第54卷 第4期后, 能在水相中形成黑色胶体, 在外加磁场下, 有好的磁响应性. 纳米Fe 3O 4有较高的饱和磁化强度, 常温下的磁滞回线表明(图2(a)), 饱和磁化强度为60 emu/g (1 emu/g = 1 A ·m 2/kg), 剩磁和矫顽力均为0, 具有超顺磁性. 表面组装金后, 饱和磁化强度降低, 分别为58 emu/g, 41 emu/g(图2(b), (c)), 但仍保持超顺磁性. 由于纳米颗粒表面具有非常大的比表面积, 有很大的表面位能, 裸露在表面的Fe 与O 原子容易吸附水中的OH −, H +, 形成一个富—OH 功能团的表面[16].偶联剂APTES 水解后, 形成硅醇缩合物, 以Fe 3O 4纳米颗粒为核生长, 在外表面形成一层带氨基的功能团. 从图图1典型样品的透射电子显微镜图(a) Fe 3O 4; (b) 氨基化Fe 3O 4; (c) 胶体金; (d) Fe 3O 4/Au图2 样品的常温磁滞回线(a) Fe 3O 4; (b) M Fe 3O 4/Au =1:1; (c) M Fe 3O 4/Au = 0.5:11(b)可以清晰看见黑色晶体变大, 粒径在10~15 nm, 说明APTES 在表面形成了有效包覆, 和文献[17]的报道一致. 根据Kumar 等人[18]的研究结论, 通过还原法制备的金纳米颗粒表面含有AuCl 4−和AuCl 2−子, 它们能与—NH 2反应生成[Au n (AuCl 4−)m ](RNH 3+)m和Au n [AuCl(RNH 2)]m 两种络合物, 并且在各种溶剂中相当稳定. 从TEM 相片(图1(d)), 可以清晰地看见合成的纳米金(图1(c))分散在表面氨基化的磁性Fe 3O 4纳米外面, 组装的金磁微粒粒径在15~20 nm. 离2.2 金磁微粒的紫外可见吸收光谱和红外分析 胶体金在530 nm 左右有共振吸收峰, 图3是胶体金(图3(c)), Fe 3O 4/Au(图3(b), M (Fe 3O 4:Au)=0.5:1; 图3(a) M (Fe 3O 4:Au)=1:1)的紫外可见吸收光谱. 合成胶体金在520 nm 有特征吸收峰, 胶体金的吸收峰位置反映了胶体金粒径的大小[19]. 520 nm 左右有吸收峰的胶体金的粒径分布在3~20 nm. TEM 图(图1(c))证实, 制备的胶体金粒径均匀, 大小为10 nm 左右. 不同比例的氨基化磁球和胶体金反应后, 吸收峰分别为548, 552 nm, 光谱发生红移, 表明粒径增大.由于Fe 3O 4本身具有吸收光的性质, 图3(a)说明Fe 3O 4相对含量较多的金磁微粒有更高的吸光值, 表观颜色也加深.图3 紫外-可见吸收光谱(a) M Fe 3O 4/Au = 1:1; (b) M Fe 3O 4/Au = 0.5:1; (c) 胶体金表面氨基化Fe 3O 4微粒在3400 cm −1左右有明显的吸收峰(图4(a)), 是胺和酰胺的N —H 键伸缩振动, 1629 cm −1左右的吸收峰为N —H 的弯曲振动; 2920和2840 cm −1左右的吸收峰代表饱和C —H 键伸缩振动. 图4两种样品的红外吸收的最大差异在500 cm −1左右, 图4(a)氨基化的Fe 3O 4微粒在617和572 cm −1432图4 样品红外光谱(a) 氨基化Fe 3O 4; (b) Fe 3O 4/Au吸收强烈, 对应为Fe 3O 4微粒的特征吸收. 组装金后, 图4(b)在618和568 cm −1吸收峰依然存在, 但明显减弱, 这可能是由于表面金纳米微粒的存在, 阻碍了内部Fe 3O 4微粒的红外吸收. 同时由于Fe 3O 4微粒表面结合了—OH, 在1629 cm −1有明显吸收峰, 推测为表面氨基化不完全所致.4332.3 金磁微粒固定化酶条件优化改变胶体金的含量, 组装含金量不同的金磁微粒. 按实验方法固定化葡萄糖氧化酶, 然后测定酶活力. 当Fe 3O 4:Au 摩尔比为0.5:1时, pH 为6, 温度25℃时, 固定化酶活力达到最高, 为529.71 U/g(图5(a)). 当金含量增高, 虽可吸附更多酶分子, 但从图2得知, 金含量升高后磁响应性减弱, 导致固定化后固定化酶的回收效率降低; 同时可能酶分子已经全部结合在金表面, 继续提高金的含量, 固定化酶活力没有明显升高.改变磷酸缓冲液的pH 为4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 在24℃恒温条件下, 用Fe 3O 4:Au 为0.5:1的比例制备的金磁微粒固定化葡萄糖氧化酶(图5(b)). 当pH 为5.5时, 固定化酶活力最高, 达498.18 U/g. 这是由于葡萄糖氧化酶的等电点在4.9左右, 固定化pH 高于等电点时, 静电吸附电势差最大, 吸附量最高, 固定化率最大; 但当pH 过高时, 由于葡萄糖氧化酶自身活性的降低也会使酶活降低. 另外, 金磁微粒表面有部分氨基未与金纳米粒结合, 氨基能吸引溶液中的阴离子, 导致固定化酶扩散层的H +浓度较溶液中的H +浓度更低. 因此, 只有溶液中的pH 为酸性时, 才能使得葡萄糖氧化酶表现出更高活力.在pH 为5.5, 恒温16, 20, 24, 28, 32, 36℃的环境中进行葡萄糖氧化酶的固定化. 固定化温度为28℃时, 固定化酶活力最高可达465.06 U/g(图5(c)), 温度的升高虽可提高酶的固定化效率, 但过高的温度又使酶失活.2.4 固定化葡萄糖氧化酶的酶学性质按照酶活力测定的方法, 取固定化酶分别在16, 20, 24, 28, 32, 36℃下测酶活力(图6(a)). 固定化酶最适温度均为24℃. 温度上升, 酶的分子结构变化, 活力下降甚至失活[20]. 但是, 相对于游离酶, 温度变化对固定化酶酶活性的改变趋势要小. 在36℃的反应条件下, 游离酶相对活性只有11%, 但固定化酶的相对酶活力还能保持30%左右, 葡萄糖氧化酶固定化后, 酶的耐热能力明显提高.在pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5下测酶活力(图6(b)), 游离酶的最适pH 均为6.5, 而固定化酶在pH 为6.0时的活力最高, 可能还是因为组装型金磁微粒表面含有部分氨基所致. 同时, 还考察了固定化酶的2009年2月第54卷第4期图5 金含量(a)、固定化pH (b)、固定温度(c)对葡萄糖氧化酶酶活力的影响图6 温度(a)、pH(b)、时间(c)和使用次数(d)对固定化葡萄糖氧化酶酶活力的影响434稳定性(图6(c))和回收次数对酶活力的影响(图6(d)). 固定化酶比游离酶保存时间显著延长, 用磁分离反复使用6次后, 酶活力只下降20%, 充分体现了金磁微粒固定化酶能反复使用的优点.3 结论本文合成了氨基化的纳米超顺磁性Fe3O4, 然后利用—NH2和Au的强相互作用, 自组装制备了功能性的金磁微粒Fe3O4@Au, 该法简易、可控. 并以GOx为模型, 考察了合成的Fe3O4@Au对GOx的固定化. 和游离酶相比, 固定化酶的稳定性、耐热性都得到明显提升, 并可在外磁场下回收反复使用. 该思路可拓展到其他酶或分子, 在酶催化、分子识别等方面将有广阔的应用.参考文献1 Laurent S, Forge D, Port M, et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical charac-terizations, and biological applications. Chem Rev, 2008, 108: 2064—2110[DOI]2 Wang Y, Ng Y W, Chen Y, et al. Formulation of superparamagnetic iron oxides by nanoparticles of biodegradable polymers for mag-netic resonance imaging. Adv Funct Mater, 2008, 18: 308—318[DOI]3 Chan D C F, Kirpotin D B, Bunn P A. Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron-oxides for the site-specific radiofre-quency-induced hyperthermia of cancer.J Magn Magne Mater, 1993, 122: 374—378[DOI]4 Segal I, Zablotskaya A, Lukevics E, et al. Synthesis, physico-chemical and biological study of trialkylsiloxyalkyl amine coated iron ox-ide/oleic acid magnetic nanoparticles for the treatment of cancer. Appl Organomet Chem, 2008, 22: 82—88[DOI]5 Bucak S, Jones D A, Laibinis P E, et al. Protein separations using colloidal magnetic nanoparticles. Biotechnol Prog, 2003, 19: 477—484[DOI]6 Doyle P S, Bibette J, Bancaud A, et al. Self-assembled magnetic matrices for DNA separation chips. Science, 2002, 295: 2237[DOI]7 Cao H Q, Wang G Z, Warner J H, et al. Amino-acid-assisted synthesis and size-dependent magnetic behaviors of hematite nanocubes.Appl Phy Lett, 2008, 928 Liu C H, Zhou, Z D, Yu X, et al. Preparation and characterization of Fe3O4/Ag composite magnetic nanoparticles. Inorg Mater, 2008,44: 291—2959 Daniel M C, Astruc D. Gold nanoparticles: Assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applicationstoward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem Rev , 2004, 104: 293—346[DOI]10 Yu H, Chen M, Rice P M, et al. Dumbbell-like bifunctional Au-Fe3O4 nanoparticles. Nano Lett, 2005, 5: 379—382[DOI]11 崔亚丽, 惠文利, 苏婧, 等. Fe3O4/Au纳米复合粒子及其光学性质. 中国科学B辑: 化学, 2005, 35: 89—9312 吴伟, 贺全国, 陈洪, 等. Fe3O4磁性纳米粒子的超声包金及其表征. 化学学报, 2007, 13: 1273—127913 Shan Z, Yang W S, ZhangX, et al. Preparation and characterization of carboxyl-group functionalized superparamagnetic nanoparticlesand the potential for bio-applications. J Braz Chem Soc, 2007, 18: 1329—133514 Frens G. Controlled nucleation for regulation of particle-size in monodisperse gold suspensions. Nat Phys Sci, 1973, 241: 20—2215 姜梅, 王善荣, 季勤. 壳聚糖膜固定化葡萄糖氧化酶的特性研究. 食品科学, 2003, 24: 38—4116 Jolivet J P, Chaneac C, Tronc E. Iron oxide chemistry: From molecular clusters to extended solid networks. Chem Commun, 2004: 481—48717 Yamaura M,Camilo R L,Sampaio L C, et al. Preparation and characterization of (3-aminopropyl)triethoxysilane-coated magnetitenanoparticles. J Mang Mang Mater, 2004, 279(2-3): 210—217[DOI]18 Kumar A, Mandal S, Selvakannan P R, et al. Investigation into the interaction between surface-bound alkylamines and gold nanoparti-cles. Langmuir, 2003, 19: 6277—6282[DOI]19 Link S, El-Sayed M A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J Phys Chem B,1999, 103: 4212—4217[DOI]20 Rauf S, Ihsan A, Akhtar K, et al. Stabilization of immobilized glucose oxidase against thermal inactivation by silanization for biosen-sor applications. Biosens Bioelectron, 2004, 19: 1337—1341[DOI]435。