固定化乳酸菌制备酸奶

凰ｔＩ　４ｉＩ，Ｚ＆ＣＨＩＮＡ　ＤＡＩＲＹ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ　

固定化乳酸菌甫　吝酸奶　

余冬生，张侈世，杨玲　

（安徽工程科技学院生化工程系，安徽芜湖２４１０００）　

摘要：通过游离乳酸茵和固定化乳酸茵的凝乳实验，证明固定化乳酸茵适合制备酸奶。乳酸发酵体系的单一因素　

和正交实验确定了发酵制备酸奶的最佳工艺条件：每１００　ｍＬ牛乳中添加２０　ｇ固定化乳酸茵；添加８％（质量分数）蔗　

糖；培养温度４２℃。　关键词：固定化乳酸茵；酸奶；发酵　

中图分类号：ＴＳ２５２．５４　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—２２３０（２００３）０５—００１７—０３　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｙｏｇｈｕｒｔ　ｂｙ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ＹＵ　Ｄｏｎｇ—ｓｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｕ—ｓｈｉ，ＹＡＮＧ　Ｌｉｎｇ　

（Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ．Ｅｎｇｎ．，Ａｎｈｕｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｎｇ，Ｗｕｈｕ　２４１０００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｓｕｉｔ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｙｏｇｈｕｒｔ　ｂｙ　ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ　ｙｏｇｈｕｒｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　

ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｄｅｔｅｒ－　

ｍｉｎｅｄ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｙｏｇｈｕｒｔ　ｂｙ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ａｄｄｅｄ　２０　ｇ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ／１００　ｍＬ　

ｍｉｌｋ：ａｄｄｅｄ　８％ｓｕｇａｒ；ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　４２℃。　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｙｏｇｈｕｒｔ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　

Ｏ　引　言　

牛奶经过乳酸菌发酵，内含的乳糖有２０％～３０％　分解成了葡萄糖和半乳糖，半乳糖被人体吸收后，可　

参与幼儿脑苷脂和神经物质的合成。发酵制作酸奶可　

使乳蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收。人体肠　

道内有许多细菌，包括对机体有益和有害的两类菌。　

在机体正常情况下有益菌占优势，经常饮用酸奶则可　

维持这种平衡。制作酸奶的历史很悠久，至今大都采　

用游离的方法制备酸奶，制作的周期长，经常更换发　

酵罐，易于受到微生物的污染，产品的质量经常达不　

到指标。Ｐｒｅｖｏｓｔｔ”等人利用海藻酸钙凝胶包埋固定化　

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行连续发酵生产酸　

奶。美国的Ｓｈａｍｐｒｏｇｒｅｔｔｉ公司应用纤维素包埋固定化　

酵母乳糖酶间歇处理高温消毒牛奶获得成功。Ｒｏｙ．Ｉ）　

等人『２　研究了以乳清渗透物为原料，利用海藻酸钙凝　

胶包埋固定化瑞士乳杆菌（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）连续发酵Ｉ４－　

产乳酸，并研究了发酵动力学。固定化乳酸菌发酵制　

备酸奶有很多的优点，本文对固定化乳酸菌发酵制备　

收稿日期　２００３一Ｏｌ—Ｏ８　作者简介：余冬生（１９６２一），男，硕士，安徽工程科技学院副教授　研究方向为应用酶学。　酸奶进行了研究，确定了最佳的工艺条件。　

ｌ　实验材料、仪器和方法　

１．１　实验材料　（１）材料。乳杆菌（南京奶业集团芜湖卫岗酸奶厂　

提供）；海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；鲜奶（南　

京奶业集团芜湖卫岗乳品厂提供）；蔗糖（天津市化学　

试剂研究所）。　

（２）培养基。选择性计数培养基　】：酵母膏２．５　ｇ，　

蛋白胨７．５　ｇ，可溶性淀粉０．２５　ｇ，葡萄糖ｌ０　ｇ，ＮａＣ１　

２．５　ｇ，牛肉膏２．５　ｇ，Ｋ２ＨＰ０４１．５　ｇ，ＫＨ２ＰＯ　１．５　ｇ，琼脂　

９　ｇ，丙酸钙３　ｇ，氯化锂３　ｇ，中国兰２　ｇ，调ｐＨ：７．０～　

７．２，在ｌ２ｌ℃下杀菌２０　ｒａｉｎ。脱脂奶培养基：质量分　数为２０％的脱脂奶在０．０５　ＭＰａ下灭菌１０　ｒａｉｎ；质量　

分数为２０％灭菌乳制备酸奶供微胶囊化芯材用。　

１．２　试验设备和仪器　

ＨＨ一６数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限　公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械　

厂）；ｐＨＳ一２５型ｐＨ计（上海雷磁仪器厂）；胶体磨均质　

机（上海大学机电厂监制）。　１．３　实验方法　（１）芯材制备方法。无菌环境用接种针挑取质　

Ｖｏ１．３１．Ｎｏ．５　２００３（ｔｏｔａｌ　１５６）　

☆　维普资讯 http://www.cqvip.com 量分数为３％乳杆菌菌体，接种于含脱脂奶培养基　

２５０　ｍＬ锥形瓶中，培养至凝乳，将凝乳的酸奶在　

３０００　ｒ／ｍｉｎ下离心１０　ｍｉｎ，去除上清液，加一定量　

生理盐水，配成一定浓度菌液备用。　

（２）固定化乳杆菌Ｈ】。取１０　ｍＬ乳杆菌制备液　加入到等体积的３％海藻酸钠溶液中，用无菌玻璃棒　

搅拌均匀，静置片刻，用１０　ｍＬ吸管吸取混合液，　

逐滴加入到５００　ｍＬ浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣＩ　溶液　

中，形成胶囊，浸泡１　ｈ以固定化，然后取出用无菌　

生理盐水清洗。　

（３）固定化乳酸菌制备酸奶的方法。鲜奶在　

６５℃下，加入糖于８．０～１０．０　ＭＰａ下均质，均质奶加　

热至９５℃，保温５　ｍｉｎ进行杀菌处理。加入一定量的　

固定化乳酸菌或接种一定量的乳酸菌，将三角瓶置于　振动培养箱中，一定温度振动培养若干小时。　

（４）固定化乳酸菌计数（倒平板法）。取胶囊　

ｌ　ｇ加入到９　ｍＬ浓度为０．２　ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸三钠溶液　

的试管中，不断振荡，大约３０　ｍｉｎ能完全溶解，制　

成１０　的稀释液，然后分取１　ｍＬ注入９　ｍＬ的无菌　

生理盐水中，依次稀释到１０“的稀释度。各稀释度　分别取０．１　ｍＬ注入到选择性计数培养基中，涂平　

板，放入３７℃培养箱中培养２　ｄ，计数。　

（４）分析方法。酸度测定方法参见文献【５】。　

ｐＨ值测定：发酵一定时间取１０　ｍＬ发酵液于烧　

杯中，用ｐＨＳ一２５型ｐＨ计测定ｐＨ值。　

２　结果与讨论　

２．１　海藻酸钙固定化乳酸菌存活时间　海藻酸钙固定化乳酸菌常放置一段时间，乳酸　

菌在胶体中的存活时间决定着接种量和酸奶是否发　

生凝乳。海藻酸钙固定的乳酸菌存活时间的实验结　

果如表１所示。　

表ｌ　海藻酸钙固定化乳酸菌存活时间　

Ｏ　７　１４　２ｌ　

２８　２．４×ｌＯ’０　４．０×ｌｏ９　７．１×ｌｏ３　３．４×ｌ０嚣　

２．６×ｌｏ嚣　

从表ｌ可以看出，制备的海藻酸钙固定化乳酸菌　

当天使用时，活乳酸菌量是２．４　Ｘ　１０　ｇ～，固定化乳酸　菌放置７　ｄ后，活乳酸菌量降为４．０　Ｘ　１０　ｇ～，若固定　

化乳酸菌放置时间延长，活乳酸菌量下降一个幂指　

数，海藻酸钙固定化乳酸菌放置７　ｄ以内可使用。　

２．２　乳酸菌和固定化乳酸菌的凝乳实验　

游离乳酸菌发酵制备酸奶需要多次转接和扩大　

培养或者高接种量乳酸菌长时间发酵产生凝乳现　

象。固定化乳酸菌胶珠含有大量的乳酸菌，加入一　

２００３年第３ｌ卷第５期（总第ｌ５６期）　定量的乳酸菌胶珠可以缩短发酵时间，同时也减少　

其他微生物繁殖生长时间。乳酸菌和固定化乳酸菌　

的凝乳实验结果如表２所示。　

表２　乳酸菌和固定化乳酸菌的凝乳实验　

乳酸菌　３％　５．３　３９　４．７２　７７　包埋法　１２　ｇ　４．３７　６０　３．８７　１３１　／ｇ（每１００ｍＬ牛奶）２４ｇ　４．４６　７３　３．８５　１３２　

从表２可以看出，质量分数为３％乳酸菌接种量　

发酵２４　ｈ后ｐＨ值下降为５．３，酸度为３９　ｏ１ｒ；发酵　

５　ｄ后ｐＨ值下降为４．７２，酸度为７７　ｏ１ｒ；每１００　ｍＬ　

牛奶中添加２４　ｇ固定化乳酸菌，发酵２４　ｈ后ｐＨ值　

下降为４．４６，酸度为７３　ｏ１ｒ；发酵５　ｄ后ｐＨ值下降　

为３．８５，酸度为１３２　ｏ１ｒ。由此可知，每１００　ｍＬ牛奶　

中添加２４　ｇ固定化乳酸菌较适合发酵制备酸乳。　

２．３　胶珠大小对产酸影响　胶珠大小决定着生物反应界面，也决定着牛乳反　

应体系的乳酸菌接种量。选择两种不同直径的菌胶珠　

（即直径２～３　ｍｍ和直径４～６　ｍｍ），分取２　ｇ加入到　２００　ｍＬ杀菌后鲜牛乳中，于３７℃下进行发酵，每隔　

１　ｈ测定其ｐＨ值和滴定酸度，其结果如图１，２所示。　

６．　６．　ｊ四６．　工　Ｑ　５．　５．　５．　５．　

＼　ｔ／ｈ　…・一４～６ｍｍ：一２～３ｍｍ　

图１　胶珠大小对ｐＨ值的影响　

ｔ／ｈ　・～４～６ｍｍ：一２～３ｍｍ　图２　胶珠大小对产酸的影响　

由图１，２知，直径２～３　ｍｍ的胶珠使ｐＨ值下降　

最快，产酸速度加快，并且在最终能获得较高的产酸　

量。直径２～３　ｍｍ的胶珠和直径４～６　ｍｍ的胶珠相比　

较，直径２～３　ｍｍ的胶珠适合发酵制备酸奶。　２．４　胶珠添加量对产酸的影响　

胶珠添加量决定着发酵体系乳酸菌的接种量，　

在理论上来讲，胶珠添加量愈多，发酵体系的ｐＨ值　

下降愈快，酸度愈高，制备酸奶的周期愈短。但在　维普资讯 http://www.cqvip.com 实际过程中，可能过多的胶珠添加量导致发酵体系　

中乳酸形成量下降。不同胶珠添加量对产酸的影响　

实验结果如图３所示。　

８　

６　＼　

２　

ｔ｝ｈ　＋１　６ｇ／１　００ｍＬ牛奶；一２４ｇ／１００ｍＬ个奶：　＋３２ｇ／ｌＯＯｍＬ牛奶；一２８ｇ／１００ｍＬｑ＝奶　图３　胶珠添加量对产酸的影响　

从图３知，胶珠添加量２８　ｇ（每１００　ｍＬ牛奶　

中）的样品经过数小时的发酵乳酸形成量最高，酸　

奶发酵体系的凝乳现象明显，较适合于制备酸乳。　

２．５　糖对产酸量的影响　

纯牛￣ＬｆｌＥ为发酵体系常因为缺糖乳酸菌发酵速　度较慢，乳酸的产生是通过酵解的途径，葡萄糖可　

以直接进入酵解的途径，而双糖如蔗糖需要经过水　

解成单糖方能进入酵解的途径。选取了葡萄糖和蔗　

糖进行乳酸发酵，其实验结果如图４所示。　

０　２　４　６　８　ｌＯ　１２　质量分数／％　一蔗糖，一葡萄糖　

图４　糖对产酸量的影响　

由图４可知，葡萄糖用量２％时，发酵体系产酸　

量约３４％；而蔗糖质量分数约６％时，发酵体系产　酸量约３４％。制备低甜度的酸奶可采用质量分数为　

２％葡萄糖发酵；制备甜酸奶可采用质量分数为６ｏＡ　蔗糖发酵。　

２．６　酸奶发酵体系最佳发酵条件的确定　

酸奶发酵体系中菌胶珠的添加量、蔗糖浓度和　

培养温度是影响酸乳质量的关键性因素，选择这三　

个因素进行正交实验。正交实验的因素、水平和实　

验结果如表３，４所示。　

表３　最佳发酵条件正交实验的因素和水平　

ｌ　２　３　１２　１４　１６　４２　４５　４７　６　８　１０　表４　最佳发酵条件正交实验的结果　

从表４知，对酸奶发酵体系中酸度影响因素的　

大小顺序是：培养温度（℃），蔗糖质量分数（％），　接种量。固定化乳酸菌发酵制备酸乳最佳发酵条　

件：培养温度４２　ｏＣ；蔗糖添加量８％；接种量１６　ｇ菌　

珠（每５０　ｍＬ牛乳中）。　

３　小　结　

海藻酸钙固定化乳酸菌胶珠放置７　ｄ时间，其　

乳酸菌的含量仍可制备酸奶。乳酸菌和固定化乳酸　

菌的凝乳实验证明，固定化乳酸菌能使发酵体系的