穿心莲内酯抗金黄色葡萄球菌生物膜作用及其与庆大霉素的协同作用_周薇

［Abstract］ Objective To investigate the effects of andrographolide （ Andro） against Staphylococcus aureus （ S． aureus） biofilms and its synergistic activity in combination with gentamicin （ GEN） ． Methods Turbidimetric method was used to detect the effect of Andro （ 100 μg / ml ） on S． aureus growth curve． S． aureus ATCC25923 and 2 clinical strains CY001 and CY002 were used for biofilm formation in vitro， dividing into a control group，an Andro intervention group，a GEN intervention group and an Andro combined with GEN intervention group． A microplate reader was used to detect the OD600nm values and indirectly observe the biofilm formation ability of each group． Scanning electron microscopy （ SEM） was used to directly observe morphology of biofilms treated with different interventions． Ｒesults Under the action of 100 μg / mL Andro，the growth curve of each strain had no difference as compared to the control group （ P ＞ 0． 05） ． Except for CY002 that could not form biofilm，there was no significant difference between the groups （ P ＞ 0. 05） ． The biofilms of CY001 and ATCC25923 in each intervention groups were less than those in the control group （ P ＜ 0. 001） ． The inhibition effect of 100 μg / mL Andro was stronger than that of 50 μg / ml GEN （ P = 0. 001，P =
描电镜观察提示各干预条件对 S． aureus 生物膜均有抑制作用，以 Andro 与 GEN 联用的抑制作用最为明显。结论 Andro
对 S． aureus 无直接杀菌作用，但对 S． aureus 生物膜具有良好抑制作用，与 GEN 联合应用，具有协同抗生物膜作用。
［关键词］ 生物膜； 金黄色葡萄球菌； 穿心莲内酯； 庆大霉素
1694
第 36 卷第 16 期 2014 年 8 月 30 日
论著
第三军医大学学报 J Third Mil Med Univ
Vol． 36，No． 16 Aug． 30 2014
文章编号： 1000-5404（ 2014） 16-1694-05
穿心莲内酯抗金黄色葡萄球菌生物膜作用及其与庆大霉素的协同作用
周 薇，沈 犁，张 燕，张佳星，姜俊如，华子瑜 （ 400014 重庆，重庆医科大学附属儿童医院新生儿科，儿童发育疾病
研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地）
［摘要］ 目的 研究穿心莲内酯（ andrographolide，Andro） 抗金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus，S． aureus） 生物膜
CHI S-3000N） 。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 穿心莲内酯对细菌生长的影响 取各冻存菌接种于 LB 培养板，挑 取 单 菌 落 于 5mL LB 培 养 液 过 夜 培 养 （ 37 ℃ ， 200 r / min） 后用新鲜的 LB 培养液以 1 ∶ 1 000 稀释后分为干预 组和对照组，分别加穿心莲内酯（ 溶剂为二甲基亚砜，终浓度 100 μg / mL） 和等量二甲基亚砜。放入恒温摇床（ 37 ℃ ，200 r / min） 培养。在不同时间点（ 0、1、3、5、7、9、11、15、19、22、25、30、 35、40、45 h） 取菌液标本（ 每个菌重复取 3 次标本） ，在 600 nm 波长下测光密度值 D（ 600） ，每个标本重复测量 3 次，以时间为 横坐标，菌液吸光度为纵坐标绘制生长曲线。 1． 2． 2 建立金黄色葡萄球菌生物膜体外模型 分别挑取单 菌落于 5 mL LB 培养液中，37 ℃ ，200 r / min，培养至稳定期。用 LB 培养液将各菌液 D（ 600） 值调至 0． 5，取 100 μL / 孔入 96 孔 板，平行做 3 个复孔，并用 LB 培养液作为空白对照，放入37 ℃ 恒温培养箱中培养，隔日换液。培养至需要时间点（ 1、2、3、4、 5、6、7 d） ，分别取出 96 孔板，洗去浮游菌，结晶紫染色后，在 600 nm 波长下测光密度值 D（ 600） 。 1． 2． 3 测定各干预条件对金黄色葡萄球菌生物膜的影响 将培养至稳定期的各菌液 D（ 600） 值调至 0． 5，分别加入 96 孔 板中（ 100 μL / 孔） ，分为 4 组，对照组（ Control） 每孔加入 10 μL DMSO，穿心莲内酯干预组（ Andro） 加入 10 μL 穿心莲内酯（ 终 浓度为 100 μg / mL） ，庆大霉素干预组（ GEN） 加入 10 μL 庆大 霉素（ 终浓度为 50 μg / mL） ，穿心莲内酯与庆大霉素联合干预 组（ Andro + GEN） 则加入 10 μL 两者的混合液（ 各 5 μL） 。平行 做 3 个复孔，设立空白对照（ 只加 LB 培养液） ，放入 37 ℃ 恒温 培养箱中培养，隔日换液。培养至生物膜稳定期（ 第 3 天） ，取 出 96 孔板，洗去浮游菌，结晶紫染色后在 600 nm 波长下测光 密度值 D（ 600） 。 1． 2． 4 扫描电镜观察各干预条件对金黄色葡萄球菌生物膜形 态的影响 选择金黄色葡萄球菌标准菌株 ATCC25923，建立 其生物膜的各组模型（ 方法同 1． 2． 2） ，在培养液底部放入已灭 菌盖玻片作为生物膜生长的载体，培养至生物膜稳定期（ 第 3 天） ，取出盖玻片，扫描电镜下观察生物膜形态。
第 36 卷第 16 期 2014 年 8 月 30 日
第三军医大学学报 J Third Mil Med Univ
Vol． 36，No． 16 Aug． 30 2014
1695
0. 003） ，and the inhibitory effect of the combination intervention group was obviously stronger than that of the Andro intervention group and GEN intervention group （ P ＜ 0. 05 ） ． Morphology observation under SEM prompted that each intervention condition had inhibitory effect on S． aureus biofilm，while the combination intervention group had the strongest effect． Conclusion Andro has no significant effect on the growth of S． aureus，but has excellent inhibitory effect on the biofilms of S． aureus． Moreover，Andro and GEN have synergistic inhibitory effect．
金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus，S． aureus） 是一种常见的社区和医院获得性感染的致病菌，随着 医学植入材料及抗生素的广泛应用，S． aureus 的感染 率逐年上升，多重耐药 S． aureus 及耐甲氧西林 S． aureus 检出率也不断增高。S． aureus 的耐药机制非常复 杂，主要涉及青霉素结合蛋白 PBP2a 变异、β-内酰胺 酶的产生、主动外排泵出系统过度表达、核糖体靶位改 变、细菌 生 物 膜 （ bacterial biofilm，BF） 形 成 等。其 中 BF 是引起 S． aureus 耐药的一个主要因素［1］，有研究表 明，生物膜内细菌对抗生素的抵抗力是浮游菌的数百 倍甚至上千倍［2］。报道显示，由细菌引起的人体感染 中至少 80% 与生物膜形成有关［3］，93． 5% 的慢性难治 性创面检测出 S． aureus 感染［4］。因此，寻找防治生物 膜相关感染的有效药物更显重要。据报道，提炼于植 物穿心莲的有效成分———穿心莲内酯 （ Andrographolide，Andro） 具有解热、抗炎、抗病毒、保肝利胆、免疫调 节、抗肿瘤等多种药理作用［5 － 8］。临床上早已广泛应 用穿心莲 内 酯 治 疗 许 多 慢 性 感 染 性 疾 病［9 － 10］，其 对 S． aureus 感染是否同样有效，抗感染机制是否与其抗 生物膜作用有关［11］，值得探讨。
［中图法分类号］ Ｒ282． 71； Ｒ378． 11； Ｒ978． 12