金黄色葡萄球菌的测定

金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

金黄色葡萄球菌的速测技术—试剂盒法金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，隶属于葡萄球菌属(Staph-ylococcus aureus )，是引起食源性疾病的主要致病因子。

金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，大多数食品及食品原料，如肉、乳、蛋制品，糖果，糕点等，均要求对金黄色葡萄球菌举行检测，我国明确规定食品中金黄色葡萄球菌不得检出。

免疫学办法是金黄色葡萄球菌的传统检测法，因其时光冗长、操作烦琐易导致食品积压，且常浮现假阳性或假阴性的结果。

依照传统的金黄色葡萄球菌检验办法(GB/T4789.10-2008)，从取样至鉴定结果最快需要4d。

利用病原微生物中特异性酶而进展起来的挑选性显色培养基技术，特异性强、敏感性好，已得到广泛的认可和应用。

DNA酶和凝固酶是重要的标志酶，目前国内外已有多种显色培养基或测试片产品。

开发敏捷、迅速、简易的检测办法对食品平安检测技术的进展有很大推进作用。

目前通常采纳的办法有反向胶乳凝聚实验(RPLA),酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等。

1．速测原理本试剂盒将病原体RNA逆转录、DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测四种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对金黄色葡萄球菌特异性引物和一对特异性探针，一次性完成金黄色葡萄球菌RNA的逆转录、DNA扩增及杂交过程，然后用防污染核酸迅速检测装置对金黄色葡萄球菌感染举行定性诊断。

2．速测范围本试剂盒用于食品中的金黄色葡萄球菌恒温扩增迅速检测。

检测敏捷度可达到＜5个病原体/mL。

3．试剂盒组成 (1)试剂盒A(-20℃保存)：恒温扩增反应液(14uL/管)，20管；阳性对比品(40uL/管)，1管(红色瓶盖)；阴性对比品(40uL/管)，1管(白色瓶盖)。

(2)试剂盒B(室温干燥保存)：防污染核酸迅速检测装置(3号装置)，20份。

(3)RNA提取试剂盒(室温干燥保存)：RNA提取试剂，20份。

金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

金黄色葡萄球菌的测定1 卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。

2 检验方法2.1 术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。

显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。

是常见的引起食物中毒的致病菌。

常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。

2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.3 培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。

3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。

分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。

培养基应是致密不透明的。

使用前在冰箱储存不得超过48h。

金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。

普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。

二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。

三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。

1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。

金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。

3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。

金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。

方法验证报告公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具微生物金黄色葡萄球菌GB/T 18204.4-2013(5)1.目的验证平皿鉴定法测定公共用品用具微生物中的金黄色葡萄球菌，来判断在本实验室此方法的适用性。

2.培养基和试剂2.1培养基和试剂2.1.1胰酪胨大豆肉汤成分：胰酪胨(或胰蛋白胨) 17g植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3g氯化钠100g磷酸氢二钾 2.5 g葡萄糖 2.5 g蒸馏水1000mL制法：将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2~7.3，分装，121 C、20 min 高压灭菌。

2.1.2氯化钠肉汤(75 g/L)成分：蛋白胨10g牛肉膏10g氯化钠75 g蒸馏水 1 000 mL制法：将上述成分加热溶解，调pH为7.4，分装，121 ℃、20 min高压灭菌。

2.1.3 Baird Parker平板成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸钠10g甘氨酸12g氯化锂(LiCl. 6H2O) 5g琼脂20g蒸馏水950 mL增菌剂的配制：卵黄盐水(30%,体积分数)50mL与除菌过滤的亚碲酸钾溶液(质量浓度=1%)10mL混合，保存于冰箱内。

制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH至7.0±0.2。

分每瓶95 mL，121℃高压灭菌15min，临用时加热熔化琼脂，每95mL 加入预热至50C的卵黄亚碲酸钾增菌5mL，摇匀后倾注平板。

培养基应是致密不透明的。

使用前在冰箱储存，不得超过48 h。

2.1.4血琼脂培养基成分：营养琼脂100 mL脱纤维羊血(或兔血) 10 mL制法：将营养琼脂加热溶化,待冷至50 C左右以无菌方法加人脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。

2.1.5革兰氏染色液2.1.5.1结晶紫染色液成分：结晶紫1g乙醇(95% ,体积分数) 20 mL草酸铵水溶液(质量浓度=1%) 80 mL制法：将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

GB4789.10-2016金黄色葡萄球菌（第二法）方法学验证报告一、验证目的验证《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10-2016》第二法在本实验室的适用性。

二、验证方法样品采样方案依据GB4789.1-2010 《食品微生物学检验总则》的要求进行，本实验样品取三个不同的典型样品进行实验，严格按照GB4789.10-2016进行。

除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阴阳性对照，标准菌株金黄色葡萄球菌（CICC10384）做阳性对照，表皮葡萄球菌（CMCC(B)26069）做阴性对照，与样品实验程序同时进行。

三、验证设备和试剂1.冰箱：SC-322 青岛海尔电器2.生化培养箱：SPX-150B-Z 上海博迅实业3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂5.天平：JE-502 上海浦春计量仪器有限公司6.显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器培养基和试剂：1.血琼脂平板北京陆桥技术股份有限公司2.Baird-Paker琼脂平板北京陆桥技术股份有限公司3.脑心浸出液肉汤（BHI）北京陆桥技术股份有限公司4.兔血浆北京陆桥技术股份有限公司5.革兰氏染液北京陆桥技术股份有限公司四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《XXXX》；五、验证步骤1操作步骤1. 1样品的稀释1.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min ，制成1：10的样品匀液。

金黄色葡萄球菌检测方法及快速测定仪金黄色葡萄球菌检测方法及快速测定仪深芬仪器厂家生产的金黄色葡萄球菌快速测定仪集温控技术、生物技术、光谱分析技术于一体的微生物致病菌检测仪，金黄色葡萄球菌快速测定仪操作简单，测试时间1小时左右，能够快速检测食品、饮用水、熟肉制品、熟制水产品、熟制粮食制品等固体、液体、表面样品中金色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、溶藻性弧菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。

金黄色葡萄球菌快速测定仪检测对象：乳制品、肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆制品、巧克力类及可可制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品、即食调味品、坚果与籽类食品、特殊膳食用食品、热处理散装即食食品、部分或未经热处理散装即食食品、其他散装即食食品、饮用水、餐具、食堂、学校、酒店、食品生产加工企业、一次性使用卫生用品、农贸市场、大中型商超等。

金黄色葡萄球菌快速测定仪技术参数：1、检测通道：16通道检测；2、检测结果：定性定量分析；3、样品类别：可检测固体、液体、表面；金黄色葡萄球菌快速测定仪仪器功能：1、显示屏尺寸：7英寸触摸屏；2、操作系统：Android 9.0操作系统，2G+16G运存（内存支持扩展128G）；3、样品信息：检测通道可独立设置样品信息（样品名称、样品来源单位名称、地址、负责人）检测人员信息（检测单位、检验人员）等；4、智能检测：单通道独立检测，多通道同时检测；5、数据分析：对检测结果进行圆饼图、柱状图、折线图汇总分析，统计；6、数据导出：支持USB数据导出，格式可选（TXT、excel）；7、GPS定位：支持定位功能；8、系统更新：支持远程更新；9、通讯接口：外置4G卡槽（全网通）、外置TF内存扩展卡槽、RS232、USB A型、USB B型、网口、wifi；11、数据上传：网口、wifi进行数据传输及对接各地数据平台；。