蛇毒类凝血酶的研究现状
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蛇 毒类凝血酶 主要 存在 于蝮亚科 ，且不 同地 区的 蝮蛇类凝血酶有较大 区别 ，见表 １。
表 １ 不 同地 区同类 型凝血酶 的区别
蛇毒 来 源
类凝血酶名称 纤维蛋白释牧方式 分子量（１（Ｄ１
大部 分蛇 毒类凝 血酶 的分子量 在 ３０ｋＤ～４５ｋＤ之 间 ，少 数 较 大 ，如 美 洲 矛头 蝮 的 Ｂｏｔｒｏｍｂｉｎ分 子量 为 ７１ｋＤ。与凝血 酶的二硫键连接 的双链结构不 同 ，蛇毒 类凝 血酶 均 由一条 链组 成 。绝 大多数 蛇 毒类凝 血酶 肽 链 中都含有 １２个～１３个半胱氨酸残基 ，有六条二硫 键［４１。除了来 自黄绿 烙铁 头（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆ ｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ） 的ｆ ｌａｖｏｘｏｂｉｎ和来 自角蝰 （Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖｉｐｅｒａ）的 Ｖｉｐｅｒａｂｉｎ 不含糖外 ，几乎 所有的蛇毒类凝血酶都是糖蛋 白，且多 呈 酸性 。与凝血酶 不同 ，蛇毒类凝 血酶寡糖链 多与天 冬酰胺连接 ，而不是 与丝 氨酸连接［５１。
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综 述
蛇毒 类凝血酶 的研 究现状
陈小飞，马海泉 ，赵冠人（解放军总医院第二附属医院药剂科，北京，１０００９１）
摘要 在 ４０余种含有类凝血酶成 分的蛇毒 中，已有 １０余种蛇毒 类凝血 酶的全部或 部分氨 基酸序 列得到 明确 ，并有 ２０余种先
由于蛇毒资源 比较有限 ，提纯工艺相对 复杂 ，从 蛇 毒液 中提取天然蛇毒类凝 血酶不仅产量不大 ，而且纯 度 难 以保证 ，因此 ，以基 因工 程技术 生产类 凝血 酶成 为近期研究的重点㈣。１９９１年 ，Ｍａｅｄａ等人工合成 了矛 头蝮蛇（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ Ｍｏｏｊｅｎｉ）类凝血酶 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的 成熟蛋 白基 因 ，在大肠杆 菌 中表达 ，采 用含 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 基因的融合基 因表达质粒 ｐＢａｔ—ＳＳ４９，在 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ１— １６表达 出含 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的融合 蛋 白，产 物以包涵体 的 形式存在 ，再经纯化 、酶切 、重折叠 ，可得到具有一定生 物 活性 的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ，但活 性较 低 （６０％左右 ）…１。Ｙｏｕ ＷＫ等 用 ＰＣＲ将 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的 ｃＤＮＡ扩增 产物转入 Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ表达载体 ｐＰＩＣ９，再经 Ｓａｉｌ限制酶消化后 ，转化 宿 主细胞 ＧＳ１ １５。经实 验证 明这种重 组 的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 在体外具有 比天然 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ更 高的生 物活性 。体 内 应用时缩短凝血时 间（ＣＴ）、出血 时间（ＢＴ）的作用也 比 天然 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ略强ｌｌ２１。
后得 到分 离和 纯化 ，在其 生物化学特征 、基 因工程研 究、药理学作用等方 面均取得 了重要成果 ，并在 临床 上得 到了广泛应 用。
关键词 蛇毒 ；类凝血酶 ；基 因工程研 究；药理作 用；临床应 用
中 图 分类 号 ：Ｒ９７３￣．１
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７２－８１５７（２ｏｏ７）０６—００５１—０４
目前 ，已经有 十余 种蛇毒类 凝血酶 的全部或部 分 氨基 酸序 列得 到 阐明 ，有 Ａｃｕｔｉｎ、Ａｎｃｒｏｄ、Ｃａｌｏｂｉｎ、Ｐａｌ— ｌａｂｉｎ、巴西矛头蝮蛇的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ、黄绿烙铁 头的 Ｆｌａｖ— ｏｘｏｂｉｎ、角蝰的 Ｖｉｐｅｒａｂｉｎ等。它们 的一级结构很相似 ， 只有少 数差异 ，如 Ｆｌａｖｏｘｏｂｉｎ的活性位 点丝 氨酸 两边 的序列 被取 代：Ｇｌｙ２０６－－－￣Ｐｈｅ、Ｇｌｙ２１０－－￣Ｔｈｒ，此外 ２２９位 的 Ｓｅｒ＿Ｔｎ，ｏ对 Ｆｌａｖｏｘｏｂｉｎ、Ｃｒｏｔａｌａｓｅ、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ与 凝 血酶 、胰蛋 白酶及激肽酶的氨基 酸序列分析表明 ，蛇毒 类凝血酶 的一级结构与胰蛋白酶 、激肽酶更为相似 。将 Ｃａｌｏｂｉｎ的 Ｎ一末端氨基酸序列与其他数种丝 氨酸蛋 白 酶序列 比较 ，Ｃａｌｏｂｉｎ与其他类 凝血酶 结构很 相似 ，有 ６１％的氨基酸残基 与 Ａｎｃｒｏｄ相似 ，有 ７２％与 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 相似，与人的 ０【凝血酶 以及血管舒缓素（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）也 具 有一定程 度的相似性 。分析表 明 ，大 多数类凝血 酶 的 Ｎ末端 为缬氨 酸。Ａｃｕｔｉｎ与 Ａｎｃｒｏｄ、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的氨基 酸 同源率 分别 为 ６６％和 ６３％嘲；Ｐａｌｌａｓｅ与 Ａｎｃｒｏｄ、Ｂａ— ｔｒｏｘｏｂｉｎ的氨基 酸同源率分别 为 ５８％和 ６８％ ；Ｐａｌｌａｂｉｎ 与 Ｃａｌｏｂｉｎ、Ａｎｃｒｏｄ和 ＴＳｖ—ＰＡ的氨基 酸同源率分 别为
蛇毒 中含有 多种 蛋 白水解 酶［１］，根据 酶 的活性 位 点 的不 同 ，可 以分 为两种 ：丝 氨酸蛋 白酶 和含 金属 的 蛋 白酶 ，后者底 物较广 ，而丝 氨酸蛋 白酶底 物则 专一 性较强 ，只作 用于特定 的肽键 ，其 中 ，最 引人注 意 的就 是类 凝 血 酶 （Ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ，ＴＬＥ ｏ ＴＬＥ在 体 外 可使血浆或血纤 蛋 白溶液 直接凝 固 ，而 在体 内因血纤 蛋 白原水平显 著下降 ，同时生成 的血纤 蛋 白凝块 结构 松散 ，导致血 浆纤维 蛋 白原浓 度 降低 ，易被纤 溶 系统 清除 ，故表现 出抗凝作 用圜。ＴＬＥ只在血管破损处促进 止血 ，因此不会造成血管 内凝血。自１９３６年 Ｋｌｏｂｕｓｉｔｚｋｉ 和 Ｋｏｎｉｇ首次 用硫 酸铵 、醋酸铅 及透 析法从 巴西 矛头 蝮蛇 毒液 中获得部分纯化 的类凝血 酶 以来［３１，迄今 已经 发现 ４０余种蛇毒中含有类凝血酶成分 ，并有 ２０余种先 后得 到分离 和纯 化。尤其是 近几年 ，有关 蛇毒类 凝血 酶分子结构及酶 学性质 的研 究取得 了很 大进展 ，有些 已经在 临床得 到了广泛 的应 用。 １ 蛇毒 类凝 血酶 的生 物化 学特 性
【作者简介】 陈小飞 ，女 ，药师 ，在读 硕士研究生 ，研究 方向 ：药 剂学。
中国药物应用与监测 ２００７年第６期 ５１
综 述
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６７％ 、９２％ 、５９％和 ６７％ 。
Ｉｔｏｈ等［９１对 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的基 因结构 进行细致分 析 ， 发现其基 因约由 ８ｋＤ组成 ，含有 ５个外显 子和 ３个 内 含子 。外显子 １包含 了 １个 ５ 非 编码区域 ，还 编码大 部分信号肽 。外显子 ５除了编码 酶的糖端外 ，还包含一 个较长 的 ３ 非 编码 序列 ，活性 位点 的组 、天冬和丝 氨 酸残基分别 由外显子 ２、３、５编码 。 ２ 蛇毒 类凝血 酶 的基 因工程研 究
表 １ 不 同地 区同类 型凝血酶 的区别
蛇毒 来 源
类凝血酶名称 纤维蛋白释牧方式 分子量（１（Ｄ１
大部 分蛇 毒类凝 血酶 的分子量 在 ３０ｋＤ～４５ｋＤ之 间 ，少 数 较 大 ，如 美 洲 矛头 蝮 的 Ｂｏｔｒｏｍｂｉｎ分 子量 为 ７１ｋＤ。与凝血 酶的二硫键连接 的双链结构不 同 ，蛇毒 类凝 血酶 均 由一条 链组 成 。绝 大多数 蛇 毒类凝 血酶 肽 链 中都含有 １２个～１３个半胱氨酸残基 ，有六条二硫 键［４１。除了来 自黄绿 烙铁 头（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆ ｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ） 的ｆ ｌａｖｏｘｏｂｉｎ和来 自角蝰 （Ｃｅｒａｓｔｅｓ ｖｉｐｅｒａ）的 Ｖｉｐｅｒａｂｉｎ 不含糖外 ，几乎 所有的蛇毒类凝血酶都是糖蛋 白，且多 呈 酸性 。与凝血酶 不同 ，蛇毒类凝 血酶寡糖链 多与天 冬酰胺连接 ，而不是 与丝 氨酸连接［５１。
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蛇毒 类凝血酶 的研 究现状
陈小飞，马海泉 ，赵冠人（解放军总医院第二附属医院药剂科，北京，１０００９１）
摘要 在 ４０余种含有类凝血酶成 分的蛇毒 中，已有 １０余种蛇毒 类凝血 酶的全部或 部分氨 基酸序 列得到 明确 ，并有 ２０余种先
由于蛇毒资源 比较有限 ，提纯工艺相对 复杂 ，从 蛇 毒液 中提取天然蛇毒类凝 血酶不仅产量不大 ，而且纯 度 难 以保证 ，因此 ，以基 因工 程技术 生产类 凝血 酶成 为近期研究的重点㈣。１９９１年 ，Ｍａｅｄａ等人工合成 了矛 头蝮蛇（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ Ｍｏｏｊｅｎｉ）类凝血酶 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的 成熟蛋 白基 因 ，在大肠杆 菌 中表达 ，采 用含 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 基因的融合基 因表达质粒 ｐＢａｔ—ＳＳ４９，在 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ１— １６表达 出含 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的融合 蛋 白，产 物以包涵体 的 形式存在 ，再经纯化 、酶切 、重折叠 ，可得到具有一定生 物 活性 的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ，但活 性较 低 （６０％左右 ）…１。Ｙｏｕ ＷＫ等 用 ＰＣＲ将 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的 ｃＤＮＡ扩增 产物转入 Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ表达载体 ｐＰＩＣ９，再经 Ｓａｉｌ限制酶消化后 ，转化 宿 主细胞 ＧＳ１ １５。经实 验证 明这种重 组 的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 在体外具有 比天然 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ更 高的生 物活性 。体 内 应用时缩短凝血时 间（ＣＴ）、出血 时间（ＢＴ）的作用也 比 天然 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ略强ｌｌ２１。
后得 到分 离和 纯化 ，在其 生物化学特征 、基 因工程研 究、药理学作用等方 面均取得 了重要成果 ，并在 临床 上得 到了广泛应 用。
关键词 蛇毒 ；类凝血酶 ；基 因工程研 究；药理作 用；临床应 用
中 图 分类 号 ：Ｒ９７３￣．１
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７２－８１５７（２ｏｏ７）０６—００５１—０４
目前 ，已经有 十余 种蛇毒类 凝血酶 的全部或部 分 氨基 酸序 列得 到 阐明 ，有 Ａｃｕｔｉｎ、Ａｎｃｒｏｄ、Ｃａｌｏｂｉｎ、Ｐａｌ— ｌａｂｉｎ、巴西矛头蝮蛇的 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ、黄绿烙铁 头的 Ｆｌａｖ— ｏｘｏｂｉｎ、角蝰的 Ｖｉｐｅｒａｂｉｎ等。它们 的一级结构很相似 ， 只有少 数差异 ，如 Ｆｌａｖｏｘｏｂｉｎ的活性位 点丝 氨酸 两边 的序列 被取 代：Ｇｌｙ２０６－－－￣Ｐｈｅ、Ｇｌｙ２１０－－￣Ｔｈｒ，此外 ２２９位 的 Ｓｅｒ＿Ｔｎ，ｏ对 Ｆｌａｖｏｘｏｂｉｎ、Ｃｒｏｔａｌａｓｅ、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ与 凝 血酶 、胰蛋 白酶及激肽酶的氨基 酸序列分析表明 ，蛇毒 类凝血酶 的一级结构与胰蛋白酶 、激肽酶更为相似 。将 Ｃａｌｏｂｉｎ的 Ｎ一末端氨基酸序列与其他数种丝 氨酸蛋 白 酶序列 比较 ，Ｃａｌｏｂｉｎ与其他类 凝血酶 结构很 相似 ，有 ６１％的氨基酸残基 与 Ａｎｃｒｏｄ相似 ，有 ７２％与 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 相似，与人的 ０【凝血酶 以及血管舒缓素（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）也 具 有一定程 度的相似性 。分析表 明 ，大 多数类凝血 酶 的 Ｎ末端 为缬氨 酸。Ａｃｕｔｉｎ与 Ａｎｃｒｏｄ、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的氨基 酸 同源率 分别 为 ６６％和 ６３％嘲；Ｐａｌｌａｓｅ与 Ａｎｃｒｏｄ、Ｂａ— ｔｒｏｘｏｂｉｎ的氨基 酸同源率分别 为 ５８％和 ６８％ ；Ｐａｌｌａｂｉｎ 与 Ｃａｌｏｂｉｎ、Ａｎｃｒｏｄ和 ＴＳｖ—ＰＡ的氨基 酸同源率分 别为
蛇毒 中含有 多种 蛋 白水解 酶［１］，根据 酶 的活性 位 点 的不 同 ，可 以分 为两种 ：丝 氨酸蛋 白酶 和含 金属 的 蛋 白酶 ，后者底 物较广 ，而丝 氨酸蛋 白酶底 物则 专一 性较强 ，只作 用于特定 的肽键 ，其 中 ，最 引人注 意 的就 是类 凝 血 酶 （Ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ，ＴＬＥ ｏ ＴＬＥ在 体 外 可使血浆或血纤 蛋 白溶液 直接凝 固 ，而 在体 内因血纤 蛋 白原水平显 著下降 ，同时生成 的血纤 蛋 白凝块 结构 松散 ，导致血 浆纤维 蛋 白原浓 度 降低 ，易被纤 溶 系统 清除 ，故表现 出抗凝作 用圜。ＴＬＥ只在血管破损处促进 止血 ，因此不会造成血管 内凝血。自１９３６年 Ｋｌｏｂｕｓｉｔｚｋｉ 和 Ｋｏｎｉｇ首次 用硫 酸铵 、醋酸铅 及透 析法从 巴西 矛头 蝮蛇 毒液 中获得部分纯化 的类凝血 酶 以来［３１，迄今 已经 发现 ４０余种蛇毒中含有类凝血酶成分 ，并有 ２０余种先 后得 到分离 和纯 化。尤其是 近几年 ，有关 蛇毒类 凝血 酶分子结构及酶 学性质 的研 究取得 了很 大进展 ，有些 已经在 临床得 到了广泛 的应 用。 １ 蛇毒 类凝 血酶 的生 物化 学特 性
【作者简介】 陈小飞 ，女 ，药师 ，在读 硕士研究生 ，研究 方向 ：药 剂学。
中国药物应用与监测 ２００７年第６期 ５１
综 述
维普资讯
６７％ 、９２％ 、５９％和 ６７％ 。
Ｉｔｏｈ等［９１对 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ的基 因结构 进行细致分 析 ， 发现其基 因约由 ８ｋＤ组成 ，含有 ５个外显 子和 ３个 内 含子 。外显子 １包含 了 １个 ５ 非 编码区域 ，还 编码大 部分信号肽 。外显子 ５除了编码 酶的糖端外 ，还包含一 个较长 的 ３ 非 编码 序列 ，活性 位点 的组 、天冬和丝 氨 酸残基分别 由外显子 ２、３、５编码 。 ２ 蛇毒 类凝血 酶 的基 因工程研 究
