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蛇毒类凝血酶生物学活性的研究王泽祥【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】3页(P1263-1265)【关键词】蛇毒;凝血酶;生物学活性;研究【作者】王泽祥【作者单位】650032,昆明,成都军区昆明总医院,昆明医学院临床学院,神经内科【正文语种】中文【中图分类】Q55类凝血酶(TLE)属于胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)，水解释放血纤肽A(fibrinopeptide A，FPA)或B(FPB)，导致纤维蛋白的单体首尾聚合而凝固，所以被称为类凝血酶。
具有抗凝、促纤溶、抗血小板聚集、保护内皮细胞、减轻脑水肿、改善血流变、保护缺血再灌注神经组织、止血等生物学活性，笔者综述其生物学活性。
1 类凝血酶的分布蛇毒类凝血酶(snake venom thrombin-like-enzyme，SVTLE)主要存在于蝰科蝮亚科蛇毒中，蝰亚科有些蛇毒中也有发现，且发现游蛇科的林蛇蛇毒中亦含有类凝血酶(thrombin like enzyme，TLE)组分，但迄今为止，眼镜蛇科和海蛇科毒蛇中尚未发现〔1〕。
自1936年Klobusitzki和Konig首次从美洲矛头蝮蛇毒(bothrops jararaca)中获得纯化的TLE后，多年来它一直备受关注。
迄今已经发现有30余种蛇毒中含有TLE，20余种得到分离纯化。
目前被人熟知的是降纤酶、巴曲酶及安克洛酶等，而国际上认可的研究都来自安克洛酶〔2-3〕。
2 TLE的生物学活性2.1 抗凝作用与促进纤溶作用急性脑梗死尤其是血栓性脑梗死患者血液处于高凝状态，且有不同程度的纤溶系统失常，是两系统失衡的结果。
降纤酶可消耗血栓形成所需要的底物而起到抗凝作用。
通过刺激内源性血浆纤溶酶原激活剂(t-PA)，或诱发血管壁释放内源性t-PA，以及减少FIB引起的继发性血小板激活而起到部分溶栓作用〔4-5〕。
蛇毒类凝血酶安克洛在毕赤酵母中的表达于学玲;李招发;方宏清;周长林;陈惠鹏【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2007(18)3【摘要】目的:利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶安克洛.方法:根据已知的天然安克洛的氨基酸序列,结合酵母偏好密码子,设计并合成了安克洛基因序列,将其克隆至表达载体pPIC9中,得到表达质粒pPIC9/Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株.采用5 L发酵罐对工程菌进行发酵,表达安克洛.在诱导表达阶段,补加甲醇-山梨醇混合碳源.经疏水柱、肝素亲和柱和阳离子柱三步分离纯化得到重组安克洛,并鉴定其体外生物学活性.结果:重组安克洛表观相对分子质量为43 000～48 000,其糖基化不均匀,去糖基后蛋白肽链的相对分子质量约29 000.重组安克洛被证明具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活力与天然安克洛相近.结论:采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学活性的重组安克洛,为大规模生产打下了基础.【总页数】4页(P412-415)【作者】于学玲;李招发;方宏清;周长林;陈惠鹏【作者单位】中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 [J], 李民;杨青;包永明;雷旭宇;许建强;安利佳2.蛇毒类凝血酶基因大肠杆菌和酵母细胞表达条件的优化 [J], 李东江;郑颖;叶锋平;张志晓;范泉水3.蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素 [J], 闫强;何桂梅;陆一鸣;陈明勇;孙树汉4.蛇毒类凝血酶基因真核表达载体的构建 [J], 张红梅;文姝;许晓楠;安利佳5.在大肠杆菌中表达蝮蛇毒类凝血酶基因gloshedobin [J], 黄星;杨青;闫明;刘铮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中国生物工程杂志China Biotechnology ，2011，31（3）：113-119蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展*刘晓飞裴剑竹杜国俊杨章民＊＊（陕西师范大学生命科学学院西安710062）摘要外源基因在大肠杆菌中表达后常形成不溶性的无活性包涵体。
包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍。
然而，在合适的条件下，包涵体经过溶解、纯化、复性过程后可在体外重新折叠成有活性的蛋白质。
迄今，已对蝰科、眼镜蛇科11种毒蛇的18个基因（包括金属蛋白酶、PLA 2、β-银环蛇毒素、心脏素素、丝氨酸蛋白酶、神经生长因子、C-型凝集素等）成功进行了原核表达，采用稀释复性、透析复性和层析复性三种方法成功进行了包涵体复性。
着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体复性所用的方法予以综述。
关键词蛇毒蛋白包涵体复性方法中图分类号Q786收稿日期：2010-10-08修回日期：2010-12-08*国家自然科学基金（30870303）、陕西省自然科学基金（SJ08C102）、中央高校基本科研业务费专项资金（GK200902029）资助项目＊＊通讯作者，电子信箱：yzhangmin@snnu．edu．cn蛇毒（snake venom ）是多种活性肽及酶组成的混合物，具有多种生物学及毒理学活性，其组分既可作为探索生命科学奥秘的基本工具，也是寻找药物先导化合物的源泉［1］。
采用传统生化分离的方法获得感兴趣的活性组分有其合理的一面，但由于天然蛇毒资源的有限性，以及不同产地、季节的蛇毒在组成方面的差异，使得分离纯化到量产的质量稳定而均一的活性组分的难度较大。
随着DNA 重组技术的发展成熟，运用大肠杆菌表达系统生产不同蛇毒蛋白的报道日趋增多。
然而，蛇毒蛋白在大肠杆菌中表达后常因形成无活性的包涵体而归于失败。
因此如何选择有效的方法，使其在体外复性是成功与否的关键。
迄今，已有很多从不同角度进行包涵体复性的报道［2-3］。
本文着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体的不同复性方法予以综述。
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
用毕氏酵母表达蛇岛蝮蛇毒类凝血酶发酵条件的优化
龙姝;黄永华;杨青
【期刊名称】《精细化工中间体》
【年(卷),期】2003(33)2
【摘要】为了提高大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶的表达量 ,利用 5 0 0ml摇瓶培养体系研究了在不同培养基、pH值、发酵时间等培养条件下分泌蛋白的浓度及活性 ,使
发酵条件得到优化 :丰富培养基比营养缺陷型培养基更利于目的蛋白的分泌表达 ,
发酵优惠条件 pH值为 6 0 ,时间为 36h ,发酵液上清能检测到靶酶的酰胺水解活性。
类凝血酶的表达量约为 4mg/L。
【总页数】3页(P42-44)
【关键词】毕氏酵母;表达;蛇岛蝮蛇毒;类凝血酶;发酵条件;优化
【作者】龙姝;黄永华;杨青
【作者单位】长沙电力学院侯家塘校区;大连理工大学化工学院
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925.9
【相关文献】
1.蛇毒类凝血酶基因大肠杆菌和酵母细胞表达条件的优化 [J], 李东江;郑颖;叶锋平;张志晓;范泉水
2.尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究Ⅲ.蛇毒凝血酶止血效应
的研究 [J], 何丽芬;肖昌华;董馥明
3.蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达 [J], 袁盛凌;王芃n;陶好霞;展德文;王艳春;王令春;刘纯杰;张兆山
4.蛇毒类凝血酶安克洛在毕赤酵母中的表达 [J], 于学玲;李招发;方宏清;周长林;陈惠鹏
5.尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究——Ⅲ.蛇毒凝血酶止血效应的研究 [J], 何丽芬;肖昌华;董馥明;杨连玺
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北京大学科技成果——海蛇降纤酶成果简介血栓形成是外科手术的常见并发症，也是现代介入性血管成形术后发生再阻塞的重要因素以及多种心脑血管疾病的致病、致死原因。
生理性血栓形成是止血的一种手段，而病理性血栓形成则可导致相关的脏器发生功能障碍。
目前心、脑部位的血栓性疾病己成为致残率与致死率最高的疾病之一，严重威胁到人类的健康。
据中国高血压联盟公布资料，我国高血压病人近1亿人，脑血管病患者450万人，每年新发生150万人，其中70%是缺血性脑血管病。
心肌梗死、心绞痛患者也有数百万人，还有大量的脑、心血管供血不足患者，四肢动、静脉血栓，眼底及内听动脉血管闭塞病人也需要抗凝和活血化瘀治疗。
蛇毒类凝血酶在体内具有较强的溶栓效果，它具有精氨酸脂酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原，水解释放血纤肽2，导致纤维蛋白的单体首尾聚合而凝固，被称为类凝血酶。
但它在体内不激活凝血因子I，由它水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联，对纤溶酶的消化高度敏感，易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用所清除，因此导致胞浆中纤维蛋白原浓度显著下降，表现降纤、抗凝的效果。
临床上，蛇毒类凝血酶已成为防治血栓栓塞性疾病的有效药物。
纤维蛋白原是决定血液粘度的重要因素之一，类凝血酶减低了血浆中纤维蛋白原水平，从而降低了全血粘度及血浆粘度，增强了血流速度。
同时与凝血酶相反，类凝血酶不诱导血小板凝聚和释放，它们与富含血小板的血浆所形成的凝块不收缩，使机体能维持正常的止血功能。
国外已有Ancrod和Batroxobin蛇毒抗凝剂，国内则有五步蛇毒祛纤酶、东北白眉腹蛇抗栓酶（清栓酶）、江浙蝮蛇抗栓酶等用于临床。
虽然上述药物的名称不同但主要成分是一致的均为类凝血酶。
这些抗凝剂因具有祛纤、降粘、溶栓、解聚等独特的性质，已用于临床治疗脑血栓形成、脉管炎、治疗冠心病、心肌梗死，也有人用于治疗癌痛综合症。
目前认为抗栓酶是治疗脉管炎、深静脉炎、静脉栓塞形成最为理想的有效药物。
