病毒的特点：
1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质
3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）
4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸
5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒
6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性
7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力
8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染
体外细胞培养的基本条件：
1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要
2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。
3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、
4、培养液营养成分、
5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、
6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、
7、温度（最适温度为35-37。C）、
8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、
9、无菌条件等
实验动物的微生物控制分类：
1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原
2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的
病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变
3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求
排除潜在感染或条件致病菌的感染
4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体
实验动物的遗传学分类
1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系
2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体
3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物
4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代
5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物
大鼠、小鼠的采血方法
1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血
0.1ml，大鼠约0.4ml
2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧，
使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
3、颈（股）动脉或颈（股）静脉采血，麻醉动物，剪去被毛，作颈静脉或劲动脉分离
术后采血
4、摘眼球采血，采血时，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球凸出，右手用弯头
镊子摘除眼球，迅速采集血液
病毒的纯化方法：
一般原则释放病毒至细胞外、去除细胞碎块、病毒悬液浓缩
1、PEG浓缩法，包括直接加入法、液体浓缩法、固体浓缩法
2、超过滤法
3、吸附法，有凝胶吸附法、红细胞吸附法
4、超速离心法
中和试验及其应用
是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度
1、鉴定病毒、
2、分析病毒抗原的性质、
3、测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果、
4、测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病
鸡胚培养的优缺点
优点
1、组织分化程度低，病毒易于繁殖
2、来源充足，其本身很少携带病毒和细菌，敏感范围广，对接种的病毒不产生抗
体
3、有神经血管的分布和脏器的构造
缺点
1、与除引起鸡胚死亡的病毒及产生痘疱的病毒外，通常不产生特异性的感染指
症，必须通过另外的实验来证明病毒的存在
2、鸡食入的抗生素会使某些病原体的繁殖收到抑制
3、某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚
PCR（聚合酶链反应）基本反应体系和步骤
反应体系：需要扩增的模板、与DNA靶序列3’末端互补的合成引物、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系。
基本步骤与反应：
1、变性，将反应体系混合物加热至94?C，维持约30~60秒，使待测双链DNA变性解链为单链模板。
2、2、退火，冷却至特定的温度（引物的Tm值左右，一般为45~65?C），一对寡糖核苷酸引物分别与正、负单链DNA序列两端互补结合。
3、延伸，将温度提高至72?C并维持一段时间，引物在聚合酶作用下，以3?端为起点，4种dNTP为原料，按碱基配对原则，沿5?→3?方向延伸，合成两条新DNA链。
基因克隆以及基本步骤：
利用酶将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的DNA 重组子，导入宿主细胞，随着宿主细胞的繁殖从而得到大量自带DNA重组子或其表达产物。
基本步骤：
1、分离或合成目的基因
2、将目的基因在体外插入载体形成重组DNA
3、将重组DNA导入宿主细胞
4、重组体的筛选、鉴定和分析
乙肝病人血清学检测的五项指标：
HBsAg（表面抗原）、抗-HBs（表面抗体）、抗-HBc（核心抗体）、HBeAg（e抗原）、抗-HBe（e抗体）
乙肝病毒血清学检查三种主要抗体及其意义
1、抗-HBe一般存在于无症状HBV携带者及活动期慢性肝炎患者中。
2、抗-HBs：是HBsAg刺激机体产生的特异性中和抗体，是保护性抗体。阳性表明机体已经产生免疫力
3、抗-HBc：包括抗-HBcIgM、抗-HbcIgG，前者是急性感染的重要指标，也是慢性活动肝炎的重要标志。阳性主要见于乙肝恢复期，慢性感染和既往感染。
空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度。凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。
50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。
ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量
CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量
LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量
血凝试验（HA）：有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，这就是所谓的红细胞凝集现象。当病毒数与红细胞数比值足够大时，病毒会与红细胞结合成网状，造成悬浮液沉淀或凝集
血凝滴度HT：将红细胞与一系列病毒稀释液混合。造成凝血的最高稀释倍数即为血凝滴度
电镜分辨率：是指分清楚两个点或两条线中心之间的最小距离的能力
负染色技术：高密度物质如重金属磷钨酸、醋酸铀等在透射电镜下形成黑色的背景反衬低密度的标本，从而清楚的显示出被衬物的细节结构
质粒：是存在于细菌染色体之外的、可自主复制的双链环状DNA，几乎完全裸露，易于分离纯化。
核酸杂交技术：用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性结合，形成杂交体，并体用相应的显示技术检测目标核酸的存在及其位置。
Southern印迹杂交：一是将待测定核酸DNA分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。步骤包括：1、待测核酸样品的制备与限制酶消化2、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品3、电泳凝胶的预处理4、转膜5、探针标记6、预杂交与southern杂交7、洗膜8、放射性自显影检测。
Nouthern 印迹杂交：将RNA 样品通过琼脂凝胶电泳进行分离，再转移到固相支持物上，用探针对其进行杂交，将具有阳性的位置与标准相对分子质量进行比较可得到RNA 种类的数目、分子大小及丰度等信息。
Ct 值：值每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct 值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。
核酸探针：是指以研究和诊断为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，用来检测特定序列核酸的DNA 或RNA 片段。
Tm 值：Tm 值就是DNA 熔解温度，指把DNA 的双螺旋结构降解一半时的温度，Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
CPE 细胞病变效应：是病毒或接种分离标本后。细胞出现的病理性变化。不同的病毒可引起不同的细胞病变效应。
干扰现象interference phenomenon ：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在细胞内的增值。
复性：变性DNA 在适当的条件下，两条彼此分开的链又可重新结合成为双螺旋结构，这个过程称为复性。方法是缓慢冷却。
小学六年级 分数混合习题
一、直接写得数。
=?5131 =?9154 =?53910 =?321
2 =?9
7141
=-5121 =+5131 =-2154 =?063
5 =?6
543
=?8552 =+4132 =?1603 =?4
121 =?416
7
=?
4320 =+5141 =?6553 =?5
392 =?351 二、 简便计算。 25843?? 232124? 151365139?? 11
511543+?
6511765114?+? 24)3143(?- 91)4151(?+
17× 916 （ 34 ＋58
）×32 59 × 34 ＋59 × 14
54 × 18 ×16 15 ＋ 29 × 310 44
－72×512
1159211597?-? 2009×2008
2007 5.0325454??-
《病毒学检验》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程名称：病毒学检验（Experimental Virology） 课程编码： 课程类别: 必修课(专业课) 适用专业: 卫生检验学本科 开课学期: 第七学期 课程学时: 63学时（理论学时27，实验学时36） 课程学分：3.5 先修课程：医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等 课程简介：病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。注重培养学生综合性思维能力，重视学生自主学习、自觉学习，分析和解决实际问题能力，以及创新思维和能力的培养。 选用教材：李洪源、王志玉主编：《病毒学检验》，人民卫生出版社，第一版，2006年7月。 参考书: 1. 张朝武主编：《现代卫生检验》，第一版，人民卫生出版社，2005。 2. 李影林主编：《中华医学检验全书》，人民卫生出版社，1996。 3. 王秀茹主编：《预防医学微生物学及检验技术》，人民卫生出版社，2002。 4. 贾文祥主编：《医学微生物学》，四川大学出版社，2005年1月。 5. 李凡、刘星晶主编：《医学微生物学》，人民卫生出版社，第七版，2008年1月。 二、课程教育目标 通过学习，使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术，知悉 常见重要致病病毒。要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子 生物学技术在病毒学检验中的应用；掌握常见重要致病病毒的生物学性状、 检验方法和预防医学意义。为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基 础。
三、理论教学内容与基本要求 绪论 （一）学时：0.5 （二）要求 【掌握】病毒的特性；病毒学检验的内容及其应用范围；病毒学检验的一般原则。 【熟悉】病毒学检验的质量控制；病毒学实验室的生物安全管理。 【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。 第一篇病毒学检验技术 第一章细胞培养技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】体外培养细胞的生物学特性；体外细胞培养的条件；组织培养的种类；细胞系和细胞株的概念；细胞培养方法；细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用；细胞检查方法；细胞的冻存。 【熟悉】用于病毒培养的细胞选择、细胞培养操作过程和细胞培养污染与监测。 【了解】细胞培养技术在病毒学研究中的发展；细胞系的鉴定。 第二章鸡胚接种技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】鸡胚的结构；鸡胚的孵育与检查；接种途径与方法及其用途；病毒的检测；鸡胚接种技术的应用。 【熟悉】实验材料、器械与准备。 【了解】鸡胚的解剖与生理。 第三章动物实验技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】实验动物的分类；普通动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物；近交系动物、封闭群动物、突变系动物、杂交群动物及其特点；常用实验动物种类及其品系；
病毒得特点: 1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构,其主要成分就是核酸与蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型得核酸(RNA或DNA) 4、因缺乏完整得酶系统与能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞得代谢系统合成蛋白质与核酸 5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新得病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主得能力,并具有对敏感宿主得侵染性与复制性 7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒得核酸能整合到宿主细胞得基因组中,并能诱发潜伏感染 体外细胞培养得基本条件: 1、条件要求高,培养液组分复杂,需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养得基本要求主要包括细胞接种(尽量选择对数期细胞接种)、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度(能耐受得ph范围为 6、6- 7、8,依靠缓冲系统调节)、 6、气体条件(细胞生长需要CO2 ,大规模培养需要有足够得氧气)、 7、温度(最适温度为35-37。C)、 8、水得纯度(一般要求去离子水或三蒸水)、 9、无菌条件等 实验动物得微生物控制分类: 1、普通动物,一级动物,要求不携带动物烈性传染病与人兽共患病病原 2、清洁动物,二级动物,在一级动物要求上,不携带对动物危害大、对实验干扰大得病原 体,外观健康,主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物,三级动物,除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除 潜在感染或条件致病菌得感染 4、无菌动物,四级动物,要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物得遗传学分类 1、近交系,指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育得动物品系 2、封闭系,不从外界引入新得血缘,非近亲交配方式得实验动物群体 3、突变系,由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状得动物 4、杂交群动物,由不同品系杂交所产生得后代 5、转基因动物,插入外源基因后能正常繁殖得动物 大鼠、小鼠得采血方法 1、剪尾采血,动物麻醉后,将尾端剪去约5mm,待血液流出采集,小鼠可每次采血0、1ml, 大鼠约0、4ml 2、眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间得皮肤固定,轻轻压迫颈部两侧,使眼 球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间,向眼底方向刺入,切开静脉丛,血流即流入取血管。 3、颈(股)动脉或颈(股)静脉采血,麻醉动物,剪去被毛,作颈静脉或劲动脉分离术后采血 4、摘眼球采血,采血时,用左手固定动物,压迫眼球,尽量使眼球凸出,右手用弯头镊子摘 除眼球,迅速采集血液 病毒得纯化方法:
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试 题【完整答案】 2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案 绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A.μm B.nm C.pm D.fm E.am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对
B:错 答案: 对 4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗
D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关 A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量( ) A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是( )
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 二、单层细胞培养： 用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系） 三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种 四、 间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定 空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度 凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量 ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量 CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量 五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩 六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存 2、冷冻干燥保存 七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体：凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体 中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和细胞培养中进行
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A．μm B．nm C．pm D．fm E．am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对 B:错 答案: 对
4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗 D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清
第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量（）A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是（） A:反向杂交 B:质谱 C:基因芯片技术 D:焦磷酸测序技术 E:超深度焦磷酸测序 答案:A
病毒的特点： 1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA） 4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸 5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性 7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 体外细胞培养的基本条件： 1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、 6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、 7、温度（最适温度为35-37。C）、 8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、 9、无菌条件等 实验动物的微生物控制分类： 1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原 2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的 病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求 排除潜在感染或条件致病菌的感染 4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物的遗传学分类 1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系 2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体 3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物 4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代 5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物 大鼠、小鼠的采血方法 1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血 0.1ml，大鼠约0.4ml 2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧， 使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
HIV病毒学检测及质量保证指南编写人员：潘品良蒋岩李敬云钟平尚红李太生 审核咨询专家及技术人员：邵一鸣康来仪朱效科王佑春汪宁朱红郭志宏季阳刘海林肖瑶邱茂锋马春涛 编写单位：中国疾病预防操纵中心性病艾滋病预防操纵中心参编单位：中国人民解放军军事医学科学院 上海市疾病预防操纵中心 中国医科大学 北京协和医院 技术顾咨询：Mike Ussery, Hao Zhang 美国国立卫生研究院过敏及传染病研究所 James W. Bremer 美国Rush 大学医学中心VQA实验室 Trever Peter 克林顿基金中国艾滋病防治项目实验室专家 Donald J. Brambilla 美国华盛顿大学新英格兰研究所 Francis F. Mandy 加拿大公共卫生局疾病预防操纵中心国家免疫学实验室
前言 随着HIV-1病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断和抗病毒治疗监测以 及艾滋病科研工作中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。自1997年艾滋病实验室首次引进HIV-1病毒载量检测技术，截至200 7年底，全国差不多配备了近120台HIV-1病毒载量检测仪，覆盖了疾控、医院、检疫、军队等系统。目前，尽管许多实验室差不多将病毒载量检测纳入艾滋病有关辅助诊断和治疗监测工作，但大多数实验室开展工作的时刻较短，体会不足，因此，急需加大该领域的培训和质量操纵工作，以保证检测结果的准确性和可靠性。 为了加大质控和保证检测质量，并得到国际上的认可，艾滋病参比实验室2004年开始参加美国NIH组织的HIV-1病毒载量检测能力验证工作。在通过考核和积存体会的基础上，2005年启动了国内HIV-1病毒载量检测能力验证工作。在主动组织实验室能力验证的同时，艾滋病参比实验室也对实验室技术人员进行培训，主动开展室内质控。这些工作对提升HIV-1病毒载量的检测技术，保证质量起到了重要作用。为了进一步规范艾滋病实验室HIV-1病毒载量检测，建立标准化质量操纵程序，准确开展各项检测及质量操纵工作，特制定本指南。 本指南是按照各种HIV-1病毒载量检测方法的技术要求，结合现行的国内外有关技术规范而制定。本指南针对HIV-1病毒载量检测的实验室设置、样品治理、检测技术、质量操纵、生物安全等方面提出指导。 本指南自2006年初正式开始编写，性病艾滋病预防操纵中心多次组织了有国内外专家参加的指南编写专项技术咨询会，与会专家对指南提出了专门多建设性意见和建议，美国NIH病毒载量检测质量保证实验室专家多次对指南进行认确实批阅和具体指导。指南编写过程中，也认真听取了实验室一线检测人员的具体需求和建议，并补充了大量的实验数据，包括HI V-1病毒载量检测值的稳固性、冻融阻碍实验与不同检测方法之间比较的实
实验一病毒对细胞的感染 目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。 材料：杆状病毒Sf9细胞 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器 步骤： 1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%； 2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜； 3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照； 4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。 实验二病毒的扩增与收集 目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。材料：杆状病毒Sf9细胞 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器 步骤：
1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%； 2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜； 3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基； 4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况； 5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管； 6、4℃，12000rpm,10min，取上清； 7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃. 实验三病毒的敏感性测定 目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。 材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿 器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅 步骤： 1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）； 2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，
病毒学检验教学大纲 《病毒学检验》教学大纲 课程编码:10272045 课程名称:病毒学检验 英文名称:virology test 开课学期:8 学时/学分:40/2.5 (其中实验学时:20) 课程类型:专业课 开课专业:卫生检验专业方向 选用教材:《病毒学检验》华西医科大学公共卫生学院自编主要参考书: 1、殷震，刘景华主编:《动物病毒学》，科学出版社，1997年版 2、熊菊贞等著:《诊断病毒学》，科学出版社，1987年版 3、黄祯祥主编:《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社，1990年版 4、纳塔莉 J.施密特;理查德 W.埃蒙斯主编，顾方舟等译:《病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术》，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社(第六版)，1993年版 5、张卓然主编:《培养细胞学与细胞培养技术》，上海科学出版社，2004年版 6、杜平等主编: 《分子病毒学原理与实验技术》，第二军医大学出版社，2002年版 7、杨占秋主编:《诊断与实验病毒学》，郑州大学出版社，2002年版 8、周先志，赵敏主编:《艾滋病诊疗新技术》，人民军医出版社，2005年版执笔人:甄清 一、课程性质、目的与任务
《病毒学检验》是微生物学检验的一个分支，是卫生检验专业必修课程。通过对病毒学检验技术的理论和实验教学，使学生掌握病毒学检验技术的基本原理、方法和操作技能，并能综合运用这些知识和技能解决病毒性疾病的诊断、预防和监测问题。 二、教学基本要求 1. 系统掌握病毒学检验技术的基本原理、方法。 2. 了解对人群健康危害较大的各种病毒的检测方法。 3. 注重培养学生综合性思维能力，结合当前发生的一些病毒性疾病流行案例进行理论和实践教学，培养学生综合分析问题和解决问题的能力。在完成本门课程学习后，使学生能够主动发现问题并能够积极探索解决问题的方案。 三、各章节内容及学时分配 第一篇病毒学检验总论(12学时) 教学目的与要求 通过该篇内容学习，使同学们认识到病毒学检验在疾病的诊断、预防与控制方面的重要地位，掌握病毒学检验的基本技术、原理和方法，了解病毒学检验方法的研究进展。 第一章病毒学检验概述(1学时) 教学目的与要求 通过本章学习了解病毒学检验的用途和内容，掌握病毒实验室常用的消毒处理方法和基本要求。 教学内容 一、病毒学检验概要 (一)病毒学在医学领域中的重要地位 (二)病毒学检验概况
《动物病毒学》实验课 讲稿 任课教师：方六荣 授课对象：2002级动物医学专业1-4班 授课时间：2004.09-2005.01
目录 实验一鸡胚接种 (1) 实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6) 实验三原代细胞培养 (9) 实验四病毒TCID50的测定 (11) 实验五中和试验 (13)
实验一鸡胚接种 一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。 二、鸡胚接种的作用 主要用于： ①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验） ④测定病毒毒力 三、材料 1、鸡胚10日龄 2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球 四、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点 1、组织分化程度低 2、可选择不同的日龄和接种途径 3、病毒易于增殖 4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒 5、容易采集和处理 6、来源充足 7、设备和操作简便易行 （二）缺点 1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒 2、母源抗体 3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
五、鸡胚的结构与功能 1、卵壳上有细孔，进行气体交换 2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中 尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。 六、受精卵的选择 1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。 2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 七、鸡胚的孵育 1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后
实验项目一减毒活病毒鸡胚培养法及病毒滴度和抗体效价测定 【目的要求】 1．掌握病毒鸡胚培养的原理及技术。 2．掌握病毒滴度的测定方法及结果判定。 3.掌握抗体效价测定技术 【实验性质】综合性实验 【实验条件】 1．基本仪器设备：孵化器、恒温培养箱、低速离心机、超净工作台等 2．基本试剂药品：鸡胚、减毒活病毒液等 3．特殊环境要求： 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授（示教）： 2.5学时 （1）病毒鸡胚接种方法 （2）血凝试验。 （3）血凝抑制试验。 2.学生操作：7.5学时 （1）鸡胚接种 （2）血凝试验对尿囊液病毒滴度测定 （3）血凝抑制试验对免疫血清效价测定 3.实验报告：学生根据结果按要求填写实验报告。 （1）病毒鸡胚接种 （2）血凝试验及血凝抑制试验的原理及结果判定 实验项目二细胞培养法对病毒疫苗TCID 测定 50 【目的要求】 1．掌握细胞培养基本技术要领。 2．掌握病毒细胞接种技术 3．熟悉观察细胞病变判定病毒感染力TCID50 【实验性质】验证性实验 【实验条件】 1．基本仪器设备：CO2培养箱，倒置显微镜，高速离心机，低温冰箱等 2．基本试剂药品：待检病毒，细胞株等 3．特殊环境要求： 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授（示教）：3学时
（1）细胞培养技术。 （2）病毒细胞接种技术。 （3）病毒感染细胞病变。 2.学生操作：9学时 （1）原代细胞制备或传代细胞单层培养 （2）接种病毒疫苗 （3）观察细胞病变判定TCID50 3.实验报告：学生根据结果按要求填写实验报告。 （1）细胞培养病毒接种技术 （2）细胞病变 实验项目三临床标本中流感病毒的诊断 【目的要求】 1．熟练掌握鸡胚培养技术。 2．熟练掌握细胞培养技术 3. 熟悉RT-PCR、ELISA等常用实验室检测技术 【实验性质】综合性实验 【实验条件】 1．基本仪器设备：生物安全柜、孵化器、恒温培养箱、PCR仪等 2．基本试剂药品：细胞株、检测试剂盒等 3．特殊环境要求：生物安全柜 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授（示教）：4学时 （1）病毒常用培养技术。 （2）常用实验室检测技术（RT-PCR、ELISA等）。 （3）临床标本中流感病毒检测流程。 2.学生操作：10学时 检测待测标本流感病毒 3.实验报告：学生根据检测结果按要求填写实验报告。
●病毒学检验的特点 ●病毒学检验的内容和应用范围 ●新发传染病病毒检测的特点 ●选择用于病毒培养的细胞遵循的原则 ●常见细胞污染的来源，种类及防控措施
●细胞培养技术在病毒学检验中的应用 第二章 ●鸡胚接种途径，以新城疫病毒接种为例，请说明接种方法好过程 ●血凝和血凝抑制试验的原理，如何判断结果 ●动物实验遵循的原则 ●鸡胚和动物实验的主要用途 ●实验动物按微生物控制分类的目的，如何分类 第五章 ●电子显微镜技术在病毒鉴定方面的优势 快速负染技术 简单，负染技术操作简单。 准确:电镜检测的结果主要是发现病毒颗粒的存在是证明病毒存在的最直接证据，对具有明显形态特征的病毒即刻可做出准确的判断。 具有同时检测多种病原的潜力，依赖于已知的核酸序列抗原或抗体信息。 ●对病毒进行检测的常规电子显微镜技术 负染技术，超薄切片制样技术，免疫电子显微镜技术 ●负染样本制作过程病毒灭活的方法
负染色是一种反衬染色，通过重金属盐溶液染色，增加标本外围密度，在生物标本的外围形成均质的电子不透明环境，而电子能够通过主要由碳，氢氧氮等元素组成的密度较低的生物样本。形成电子透亮的白色，而时生物标本，显示出负的（较透明的）反差，成像后的效果 为在黑色背景下低密度的标本（病毒颗粒）呈现白色透亮状态，从而形成负染色成像。 优点。大大提高了标本的反差和分辨力，既能够清晰显示出病毒的超微结构。简便易行，不要求高纯度的标本制备技术技通常不需要对样本进行纯化，有杂质也不会影响对病毒形态8的辨别。染色技术本身不改变生物样本的活性剂，不因染色造成病毒形态的改变。 第六章 ●流感病毒和腺病毒的核酸检测方法的异同 ●鼻咽拭子是呼吸道病毒检测常用的标本，采集此类标本是注意事项。除鼻咽拭子之外， 呼吸道病毒感染检测还可以采集哪些标本 ●举例说明常见呼吸道感染病毒分离培养时使用的敏感细胞系 ●肠道病毒和引起肠胃炎的腹泻病毒通常包括哪些，其病毒学地位分别是什么，其基因组 特征分别是什么？ ●肠道病毒和腹泻病毒的区别是什么？ 肠道病毒EV是小RNA病毒科肠道病毒属，包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可病毒，新型肠道病毒。可感染人或动物，在宿主消化道中复制增殖，表现为隐性感染腹泻病毒包括轮状病毒，诺如病毒，札如病毒，星状病毒，肠道腺病毒，可引起急性肠
病毒学检验重点 Prepared on 22 November 2020
病毒的特点： 1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA） 4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸 5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性 7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 体外细胞培养的基本条件： 1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度（能耐受的ph范围为，依靠缓冲系统调节）、 6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、 7、温度（最适温度为35-37。C）、 8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、 9、无菌条件等
实验动物的微生物控制分类： 1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病 病原 2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害 大、对实验干扰大的病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病 变 3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带 病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染 4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物的遗传学分类 1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系 2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群 体 3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物 4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代 5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物 大鼠、小鼠的采血方法 1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集， 小鼠可每次采血，大鼠约 2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻 轻压迫颈部两侧，使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼 底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
病毒学实验考试备考指导 编者：程家国（大理大学）指导教师：吴利先 鸡胚接种 原理 鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。 鸡胚的结构与功能: 鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚层、内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官 卵壳:上有细孔，进行气体交换 壳膜:使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 气室:呼吸和调节压力 绒毛尿囊膜:起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 尿囊腔:胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 羊膜与羊膜腔:其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 卵黄:在胚胎发育早期供给鸡胚营养 卵白:在胚胎发育晚期供给鸡胚营养 受精卵的选择:最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的 受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 孵育:孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 相对湿度：50%-60% 必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。 检卵:自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。 孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。 未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹 活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明显，甚至无胚动。 死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。 接种前处理:用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。 对鸡胚进行消毒。
病毒学实验技术 实验一鸡胚接种 器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI） 一．精卵的选择、孵育和检卵 1.受精卵的选择 1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 2）最好是白克蛋 3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 2.孵育 1）孵箱温度保持37.5—38.5℃ 2）相对湿度：50-60% 3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后 4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次 3.检卵 孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。 二．鸡胚的结构 1．卵壳上有细孔，以行气体交换 2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流 3．气室呼吸和调节压力 —卵壳孔交换 4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O 2 5．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。 6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水 7．卵黄早期养分 8．卵白晚期养分 三．接种前处理 1．做接种记号 2．消毒 四．接种途径 卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体 1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖 方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下 2）碘及酒精消毒气室端 3）钢锥在气室中央锥一小孔 4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚 5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚 方法二：1）2）同一 3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒 4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚 5）封孔，续孵，弃24h内死胚 2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖 方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒
《病毒学检验》复习题 第一章细胞培养技术 1.什么是原代细胞培养、传代细胞培养、细胞系、细胞株？ 2.体外培养细胞有何特性？贴壁细胞有何特性？ 3.体外培养细胞一代周期有几个阶段，各有何特点？ 4.消化液有哪些？胰酶有何作用特点？ 5.以鸡胚为例，如何制备原代细胞培养？注意事项有哪些？ 6.如何控制细胞培养中的细菌、真菌、支原体污染？ 7.怎样保存细胞？ 第二章鸡胚接种技术 1.鸡胚有哪些结构？分别适合何种病毒的接种培养？ 2.活胚的检查有几个方面？ 第三章动物实验技术 1.实验动物类型有哪些？ 2.常用实验动物有哪些？有何用途？ 3.小鼠和大鼠的常见接种途径有哪些？ 4.如何给实验动物编号？ 5.使用实验动物有何原则？ 第四章病毒滴度测定 1.病毒滴度测定有哪些方法？其原理分别是什么？ 2.简答空斑形成单位法的原理。 3.简答血凝和血凝抑制试验的原理、用途和注意事项。 4.50%终点法的原理和注意事项。 5.活细胞染料有哪些？ 6.何为重复感染数？CCID50、PFU？CCID50和PFU如何换算？ 第5章病毒的纯化与保存 1.病毒纯化有何原则？ 2.常见病毒纯化的方法有哪些？ 3.病毒保存的方法有哪些？各有何特点？
第六章病毒血清学实验方法 1.简答中和试验原理和用途。中和试验中标准血清的抗体浓度是多少？ 2.补体结合试验原理与结果判定？ 3.简答血凝试验与血凝抑制试验的原理、结果判断和应用。 4. 4个血凝单位的含意是什么？用途是什么？ 5.补体结合试验中使用的溶血素是多少个血凝单位？ 第八章核酸杂交技术 1.何为探针？ 2.核酸杂交的方法有哪些？ 第九章聚合酶链反应 1.何为PCR？ 2.简答PCR的原理。 3.PCR反应体系包括哪些成分？ 第十三章电子显微镜技术 1. 电子显微镜技术有哪些方法？ 第十四章病毒分离培养 1.如何采集病毒检验标本？有哪些注意事项？ 2.如何做病毒的鉴定？ 第十五章病毒感染的早期诊断技术 病毒早期感染的诊断项目有哪些？ 第十七章疱疹病毒及其检验 1.疱疹病毒生物学特性怎样？ 2.单纯疱疹病毒临床表现有哪些？一般潜伏于哪些部位？ 3.EBV所致疾病有哪些？如何做培养？ 4.水痘-带状疱疹病毒有何感染特点？怎样传播？ 第十八章乳头瘤病毒及其检验 1.乳头瘤病毒形态结构有何特点？ 2.怎样进行HPV的实验室检验？ 3.宫颈癌普查常用的方法是什么？
常规病毒学实验技术 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm 的烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负 压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中 央的小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。
各实验具体步骤： 病毒学实验 1.抗体检测： 有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 目的意义： 1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。 血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。 器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验步骤：
(一)血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul，第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照； 2、吸25ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取25ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul， 3第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。 4、室温静置10-30分，观察结果 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价 (二)血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释 度。（根据学农实验配置4单位抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗原的稀释倍数。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul，于第一排第1孔中加入25ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取25ul至第2孔混匀，吸取25ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，经倍比稀释 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul，微量震荡器震荡2min混匀； 4、室温静置20min；