牛奶中_内酰胺酶来源及其检测方法研究进展_陈美霞

Sykes 等 和 [30] Novick 等[31]利用碘量法对β-内酰胺 酶进行检测，根据 15~20 min 后酶将抗生素完全降解 后产生的吸光度值的变化进行β-内酰胺酶的定量，该 方法检测限为 0.001 U。基于碘量法开发的优尔齐 TMβ-内酰胺酶残留定性及定量检测试剂盒，定量检 测 限 为 1 U/mL，借 助 酶 标 仪 30 min 内 即 可 出 检 测 结 果 [32]。 张 鑫 潇 等 发 现 碘 量 法 可 用 于 生 鲜 奶 及 奶 制 品 中 β- 内 酰 胺 酶 的 检 测 ，但 是 检 测 限 比 较 高 [2]。 2010 年谢岩黎等[33]的研究表明当β-内酰胺酶浓度大
β-内酰胺类抗生素因其抗菌谱广、价格便宜广泛 应用于畜牧生产中，如治疗乳房炎及其他细菌感染等 疾病[9-11]。但是由于使用不当，如滥用、误用尤其是不 按说明经过休药期处理等原因，出现了牛奶中抗生素 残留的问题 。由于 [12-13] 抗生素存在的普遍性，国家出 台相应法规要求牛奶中抗生素“不得检出”，并要求对 所有生鲜乳进行抗生素含量检测，超标者不得出售。 因此，不法商家便在牛奶中添加抗生素降解剂，避免 “有抗奶”的检出。崔生辉等[14]、Guay 等[15]通过实验证 明 这 些“ 抗 生 素 分 解 剂 ”的 主 要 成 分 正 是 β- 内 酰 胺 酶。另外，由于国内大多数乳品企业对抗生素超标的 牛奶采用降价收购的政策，使得 1 吨“有抗奶”和“无抗 奶”价格相差近千元。在利益的驱动下，不法商家会 在牛奶中添加抗生素降解剂生产人造“无抗奶”[1]，从 而导致牛奶中β-内酰胺酶的残留。同时，随着科学技 术的发展，纯化β-内酰胺酶的工艺已经非常成熟，目 前具有一定生产规模的β-内酰胺酶生产厂家不少于 30 家[2]。
1 β-内酰胺酶结构与功能
β-内酰胺酶，英文名称为β-Lactamase，是细菌代 谢过程产生的一种蛋白质，可特异性分解β-内酰胺类 抗 生 素 。 目 前 发 现 并 报 道 的 β- 内 酰 胺 酶 有 200 多 种。根据β-内酰胺酶的等电点、结构、水解产物、是否 受克拉维酸抑制等，可以将β-内酰胺酶分为五大类：
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中国乳品工业
牛奶中β-内酰胺酶来源及其检测方法研究进展
陈美霞 1，2，文芳 1，2，郑楠 1，2，杨晋辉 1，2，张勇 1，2，陈璐 1，2
（1.农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物 营养学国家重点实验室，北京 100193）
2 β-内酰胺酶残留的风险
2.1 β-内酰胺酶在牛奶中残留的内源性因素 研究表明，许多微生物可以产生β-内酰胺酶 。 [5]
其中，革兰氏阳性菌可以产生青霉素酶和头孢素酶 2 种β-内酰胺酶；而革兰氏阴性菌产生的β-内酰胺酶 却种类繁多，截至目前，已报道有 200 多种。目前关于 牛体内或牛奶内产β-内酰胺酶的微生物是否会造成 牛奶中β-内酰胺酶残留主要存在以下两种观点。
高延玲等[6]及谢磊等[7]认为微生物产生的β-内酰 胺酶在牛奶中残留率比较高。2010 年高延玲等[6]在已 查明无人为β-内酰胺酶添加的情况下对 140 批生鲜
乳进行检测，β-内酰胺酶检出率达 52.9%。与之类 似，2014 年谢磊等[7]对北京市 10 家养殖场的 593 份生 鲜乳进行分析，内源性β-内酰胺酶残留阳性检出率达 28.7%。这可能与贮存时间延长、抗菌药物不合理使 用等因素促进细菌产β-内酰胺酶增加有关[6-7]。
以青霉素为例，约 74%的病人对其过敏。究其机 理，一方面，青霉素降解产物——青霉素噻唑酸可与 蛋白结合形成抗原导致过敏；另一方面，青霉素在内 部β-内酰胺环开环后会高度聚合形成高聚物导致过 敏 。 [2] 而郭宗儒等[16]及彭司勋等[17]指出，β-内酰胺酶 可催化青霉素开环生成青霉素噻唑酸。因此，从原理 上讲，β-内酰胺酶有引起人体过敏的风险。另外，因 为β-内酰胺酶分解其他β-内酰胺类抗生素的降解产 物中有许多是抗生素的类似物，而其分解物的危害尚 不清楚，因此长期饮用含β-内酰胺酶处理的牛奶，也 存在使人产生耐药性、降低对传染病的抵抗能力的风 险[2]。另外，滥用解抗剂可能会引入其他的致病菌、致 癌物质，长期饮用解抗剂处理的奶对身体的伤害不言
Monographs 专题论述
而喻。 同时，不法商家添加以β -内酰胺酶为主要成分
的解抗剂来掩盖抗生素使用的事实，扰乱市场，不利 于我国奶业的健康可持续发展。 2.4 β -内酰胺酶在牛奶中的残留现状
2007 年崔生辉等[14, 18]对市售的 38 份牛奶样品进 行检测，60%以上样品呈β-内酰胺酶阳性。2010 年高 延玲等[6]对 42 个奶牛养殖场和养殖小区的 140 批生鲜 乳进行检测，β-内酰胺酶检出率达 52.9%。2012 年宁 波市公布的《2012 年下半年宁波市乳制品评价性抽检 结果通报》中显示该市出入境检验检疫局检验检疫技 术中心对 608 批次奶及奶制品进行检测，β-内酰胺酶 呈阳性的达 40 批次。2013 年农业部对西部地区某省 异地抽检时发现 12 份样品中唯一一份不合格的原因 便是β-内酰胺酶超标 。 [19] 2014 年谢磊等[7]对北京市 10 家养殖场共计 593 份生鲜乳进行检测，有 28.7%的 样品呈β-内酰胺酶阳性。
（1.Ministry of Agriculture - Milk and Dairy Product Inspection Center (Beijing), Beijing, 100193, China; 2.State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100193, China）
25 Vol.43，No.12 2015(total 301)
专题论述 Monographs
表 1 杯碟法在检测牛奶中β-内酰胺酶的应用
序号
方法概述
检出限 参考文献
以藤黄微球菌为敏感菌指示剂，利用舒巴
1 坦对β-内酰胺酶的抑制作用对β-内酰胺 4 U/mL [14]
酶进行检测方法。
通过比较添加和未添加β-内酰胺酶抑制
虽然微生物可以产生β-内酰胺酶，可能在牛奶中 残留。但是，目前对市场和消费者危害最大的并不是 内源性β-内酰胺酶，而是人为添加的β-内酰胺酶。 甚至有人认为，正是这些外源性降解剂的添加使得假 “无抗奶”大量充斥市场。 2.3 牛奶中β-内酰胺酶残留的风险
虽然目前还没有关于β-内酰胺酶残留实际危害 的报道，但是，牛奶中残留的β-内酰胺酶对人体健康 及奶业健康发展而言存在一定的风险。
收稿日期：2015-06-19 作者简介：陈美霞（1991-），女，硕士，从事牛奶质量评价及检测方法
研究。 通讯作者：文芳
242015 年第 43 卷第 12 期（总第 301 期）
（I）CEP-N 酶（头孢菌素酶），（II）PEN-Y 酶（青霉素 酶），（III）BSD-Y 酶（广谱酶），（IV）EBS-Y 酶即 ES⁃ BLS（超广谱酶），（V）金属酶（金属β-内酰胺酶）[3]。β内酰胺酶对抗生素的作用主要有水解和非水解两种 方式 。 [4] 大多数β-内酰胺酶的活性位点具有一个纵 行沟状结构，该结构疏松易弯曲，利于底物的结合。 抗生素β-内酰胺环上的羰基碳可以不可逆的结合在 该活性位点处的丝氨酸上，使抗生素β-内酰胺环解 开，造成抗生素降解，避免抗生素的检出。另外一些 抗生素如金属酶，它们是利用二价金属离子与组氨酸 或半胱氨酸结合，并与抗生素羰基中的酰胺键相互作 用，抑制抗生素发挥作用，避免抗生素的检出。目前 国际上研究比较活跃的是超广谱β-内酰胺酶和头孢 菌素酶。
0引言
近些年，牛奶抗生素残留成为奶及奶制品质量安 全的一个重点问题。因为β-内酰胺酶可使β-内酰胺 类抗生素降解，导致空间结构破坏或功能丧失，从而 可避免牛奶中残留抗生素的检出 。 [1] 因此，不法商家 人为地向奶中添加β-内酰胺酶使抗生素降解，避免抗 生素的检出。β-内酰胺酶的添加不仅掩盖了抗生素 残留的事实，同时引入了抗生素降解产物及β-内酰胺 酶残留所带来的风险[2]。为了规范奶产品安全生产及 奶制品质量安全，我国已将β-内酰胺酶列入非食用添 加剂名单并要求进行全国监测。本文从牛奶中β-内 酰胺酶残留的原因、现状、风险及检测方法等方面进 行综述，为β-内酰胺酶研究提供参考。
广泛、发展最早的一种方法。它的原理是选择对抗生 素敏感的细菌为指示剂，根据抑菌圈的大小判断酶的 多少。主要有显色培养法[20]、三维试验法[21]、纸皮扩散 法[22]、聚合酶链式反应法[23]、杯碟法[24]等。其中最为常 用的是杯碟法（表 1）。
2014 年李欣南等[28]针对微生物法检测Fra Baidu bibliotek-内酰胺 酶中常用的杯碟法的操作要点及注意事项进行了梳 理，为实际检测工作提供参考。
2 剂得到的抑菌圈大小间接判断β-内酰胺 0.005
[25]
酶的存在与多少。
IU/mL
文献标识码：B
文章编号：1001-2230（2015）12-0024-05
Research on the sources and analytical methods of β-lactamase residues in milk
CHEN Mei-xia1，2，WEN Fang1，2，ZHENG Nan1，2，YANG Jin-hui1，2，ZHANG Yong1，2，CHEN Lu1，2
Abstract：This paper reviews the sources, risks, and developments of main analytical methods of β-lactamase residues in milk in order to pro⁃ vide a piece of information of the detectors. Key words : β-lactamase; milk; residues; risk; analytical methods
不管这些检出的β-内酰胺酶是内源性还是外源 性造成的，如此高的检出率足以说明牛奶中β-内酰胺 酶残留的严重性，说明β-内酰胺酶的问题不容小觑。 这警示我们需要加强牛场牛奶卫生、运输以及储存、 市场销售流通等各环节的管理，减少牛奶中β-内酰胺 酶的残留。
3 β-内酰胺酶主要检测方法
3.1 微生物法 微生物法是在实验室检测β-内酰胺酶使用比较
虽然目前实验室中微生物法使用比较广泛，但费 时费力，不适合现场及快速检测工作。 3.2 碘量法
碘量法也是目前比较常用的一种检测方法。它 是基于β-内酰胺酶分解抗生素后的降解产物与碘发 生氧化还原反应进行β-内酰胺酶检测的方法。中华 人民共国药典（2005 版）中推荐使用碘量法对青霉素 酶活性进行检测[29]。同时，目前市场上许多快速检测 试剂盒也是基于碘量法进行的设计。
然而，张鑫潇等[2]及刘琴等[8]认为在无外源β-内 酰胺酶添加的情况下，微生物产生的β-内酰胺酶残留 量及残留率很低，几乎无法检测到。他们分析可能是 牛奶采集方式、牛奶成分、消毒方法、包装储存方式等 情况不适合产β-内酰胺酶的微生物生存。因此，张鑫 潇等[2]及刘琴[8]等认为基于目前的认识和实践，牛奶中 检出的β-内酰胺酶是外源性添加的。 2.2 β-内酰胺酶在牛奶中残留的外源性因素
摘 要：综述了牛奶中β-内酰胺酶残留的内源性和外源性因素、残留风险，以及目前牛奶中β-内酰胺酶检测的微生物法、碘量法、酸
定量法、头孢菌素显色法、仪器检测法、生物传感器法及其他检测方法的研究进展。旨在为检测人员及研究工作者提供一种参考。
关键词：β-内酰胺酶；牛奶；残留；风险；检测方法
中图分类号：TS252.7