下载文档原格式
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
DNA损伤检测—单细胞凝胶电泳技术的研究
朱文文;王晓涛
【期刊名称】《微量元素与健康研究》
【年(卷),期】2007(24)3
【摘要】单细胞凝胶电泳(SCGE)又称为彗星实验,是一种可以在单个细胞水平上检测DNA断裂的技术。
近年来该技术被广泛应用于特定的DNA损伤、DNA特异性染色、DNA修复、遗传毒理、环境生物监测等方面的研究。
在前人的基础上对该实验方法做了进一步的研究和改进,使改进后的方法更加快速简捷、经济可行。
【总页数】2页(P6-7)
【关键词】单细胞凝胶电泳;DNA损伤
【作者】朱文文;王晓涛
【作者单位】河南科技大学动物科技学院;河南平顶山工学院
【正文语种】中文
【中图分类】R329.27
【相关文献】
1.应用单细胞凝胶电泳技术检测K562细胞 DNA损伤的研究 [J], 景学安;张显忠;宋文刚;宗传龙;康莉
2.单细胞凝胶电泳技术检测丙烯酰胺亚急性中毒大鼠的单细胞DNA损伤 [J], 杨淑芸;李国良;付正英;张引国;张金波
3.单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展 [J], 赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚
4.用单细胞凝胶电泳技术检测粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤的研究 [J], 甘耀坤;乔琰;鲁志松;刘凯于;杨旭
5.单细胞凝胶电泳技术检测蜘蛛血细胞DNA损伤研究 [J], 李锐;李生才;杨怀卿;刘佳;罗原
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
单细胞dna彗星实验步骤彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish 分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
凋亡细胞单细胞凝胶电泳结果-回复什么是细胞凝胶电泳？细胞凝胶电泳是一种常用的生物物理实验技术，用于分离和检测DNA和RNA的大小、形状和电荷。
凝胶电泳通过将DNA或RNA分子放置在电泳凝胶中，并施加电场，使分子按照大小和电荷移动，从而分离这些分子。
细胞凝胶电泳则是将细胞以其整体形态进行电泳分析。
凋亡细胞单细胞凝胶电泳是一种特殊的细胞凝胶电泳技术。
凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，与细胞自我消亡的生理活动相关。
在这种电泳实验中，我们将关注凋亡细胞的特征和分子差异。
实验步骤：第一步：样本准备首先，我们需要收集含有凋亡细胞的样品。
这些样品可以是从细胞培养基中恢复的细胞，也可以是从生物组织中提取的细胞。
确保样品含有足够数量的凋亡细胞，以便能够得到可靠的结果。
第二步：制备细胞凝胶接下来，我们需要制备细胞凝胶。
通常使用琼脂糖凝胶，如琼脂糖-磷酸盐凝胶。
根据实验需求，还可以添加DNA标记物或染料，以便更好地观察凋亡细胞。
第三步：细胞孵育将样品中的凋亡细胞混合到凝胶中，并进行细胞孵育。
在适宜的环境条件下，凋亡细胞会进一步分解和分离，使得分析结果更加准确。
第四步：电泳在孵育过程结束后，将凝胶放置于电泳槽中，并施加电场。
通常选择连续电场或脉冲电场来实现凋亡细胞的分离。
电场可以使凋亡细胞根据大小和电荷向阳极或阴极移动。
第五步：分析结果根据凋亡细胞在凝胶中的移动情况，可以分析并评估这些细胞的大小和电荷差异。
通过测量移动距离和形成的能带图案，我们可以定量地描述凋亡细胞群体的特征。
这些特征可以帮助我们了解凋亡过程中的细胞变化及其相关的生物学特性。
实验应用：凋亡细胞单细胞凝胶电泳在细胞生物学和医学研究中具有广泛应用。
通过观察凋亡细胞的大小、形状和电荷变化，我们可以了解细胞死亡过程中发生的分子事件，并研究其与疾病和病理过程之间的关系。
这项技术有助于揭示细胞凋亡的机制、筛选和评估新型药物，以及检测病理样本中的细胞凋亡情况。
总结：凋亡细胞单细胞凝胶电泳是一种用于分析凋亡细胞特征和分子差异的重要技术。
单细胞微凝胶电泳技术的研究和应用王海燕;池翠萍【期刊名称】《癌变．畸变．突变》【年(卷),期】2001(013)004【摘要】在研究辐射生物效应中，检测DNA损伤的方法很多。
例如：细胞遗传学方法染色体畸变、微核、姐妹染色单体互换等等。
但上述方法费时费力，并有一定的局限性。
八十年代由Osting等首次提出的用微板电泳技术检测单细胞水平DNA损伤，后经Singh等进一步改进和完善了单细胞微凝胶电泳（Single Cell microgel electrophoresis简称SCGE）技术，又称彗星检测法（Comet assay)。
该方法突破了传统局限性，即设备、操作简便、所需细胞少，无需放射性示踪剂，而且灵敏、快速、整个实验过程从来样到结果分析可在一个工作日完成的新技术。
因此，该技术在国外有关研究领域已得到广泛应用。
近年来，国内一些研究领域也引进和建立此方法。
主要用于环境诱变突剂或诱癌剂引起的DNA损伤／修复的研究；癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学预后的研究；作为生物标记进行生物监测及流行病学；毒理遗传学等诸多领域的研究。
目前，也有一些专家学者将些技术应用于植物细胞的研究。
SCGE技术在本实验室已建立，其方法是使包埋于琼脂糖中的细胞经裂解去掉细胞浆，在碱性环境下DNA双链螺旋成为单链，在电泳电场作用下DNA断链离开细胞核向正极迁移出现“彗星”状拖尾现象，再通过荧光染料溴化乙啶结合DNA显色检测其损伤程度。
为将此技术推广于辐射生物效应体内外研究中，本实验选用在辐射生物效应中经常用的人血淋巴细胞（HBL），中国仓鼠肺细胞（CHL）和兔血淋巴细胞这3种细胞探索利用此技术检测DNA损伤的可行性，实验结果表明：SCGE技术能够对单个细胞DNA损伤进行研究，荧光测定核DNA直径和迁移DNA（即慧星尾）长度，而尾长度和尾部荧光强度与DNA 链的断裂呈正相关。
由于“彗星”成像是因损伤DNA在电泳中从核内迁出，因此它的尾长和密度等是评价与量化电泳结果的重要内容。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
DNA损伤检测方法及DNA修复机制概述DNA是生物体内重要的遗传物质，它携带了生物体遗传信息的编码。
然而，由于各种外界和内源性因素的影响，DNA分子可能会受到损伤，这可能导致细胞功能异常甚至引发严重的疾病，如癌症。
因此，准确检测DNA损伤并了解DNA修复机制对于维持细胞的稳态至关重要。
DNA损伤检测方法是一种评估DNA损伤程度和类型的基因学工具。
下面将介绍常见的DNA损伤检测方法和DNA修复机制的概述。
一、DNA损伤检测方法1. 单细胞凝胶电泳（SCGE）：SCGE是一种常用的DNA损伤检测方法。
它通过将细胞固定在凝胶上，通过电场作用将损伤的DNA片段移动到凝胶上。
损伤的DNA片段在凝胶上呈现出“尾巴”状，以此来评估DNA损伤的程度。
2. 酶联免疫吸附分析（ELISA）：ELISA是一种免疫学方法，可以用于检测DNA损伤的体内和体外标志物。
通过特异性抗体与已修复的DNA损伤标志物结合，ELISA可以定量评估DNA损伤的程度。
3. 荧光染料：通过与DNA结合的荧光染料，可以直接观察和评估DNA损伤。
常见的荧光染料有乙酰丙酮、DAPI、SYBR Green等。
这些染料与损伤DNA结合后会发出荧光信号，通过荧光显微镜观察和图像分析，可以评估DNA损伤的程度和位置。
二、DNA修复机制概述DNA修复是细胞对于DNA损伤的主要生理响应机制，细胞通过多种方式修复DNA损伤，以维持基因组的完整性。
1. 直接修复：直接修复是最简单的DNA修复机制之一，通过修复DNA中的化学修饰来恢复DNA的完整性。
常见的直接修复机制包括光反应修复、DNA甲基化修复和脱氨酶修复等。
2. 错配修复：错配修复主要用于修复DNA中的碱基配对错误。
细胞通过识别和修复DNA链上的错配配对，保证了DNA双链的稳定性和准确性。
错配修复机制包括互补链修复（MMR）和核酸切除修复（NER）等。
3. 核苷酸切除修复：核苷酸切除修复是修复DNA中严重损伤的一种重要机制。
（一）原理单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索（二）仪器．全磨砂载玻片．号盖玻片．微量吸管和吸头．冰盒．电泳仪．荧光显微镜（三）试剂．正常熔点及低熔点琼脂糖.．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.．缓冲液（）.．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.（四）方法.制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物地组织或培养地细胞系，或从活体组织分离出地原代细胞等.动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性地原代细胞进行测试.选择合适地培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>，细胞密度为(～)×备用.文档来自于网络搜索. 凝胶制片为了加强凝胶对玻片地附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加℃水浴后地％～％正常熔点琼脂糖µ.然后再铺胶层.第层：取密度为×地细胞悬液，以体积比为：地比例与预热到℃地％低熔点琼脂糖混匀，取µ加到第层胶上，铺匀凝固；第层：以％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”. 文档来自于网络搜索.细胞裂解将细胞“三明治”载玻片浸入新配制地预冷℃地裂解液中，保持℃ .解旋细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制地碱性电泳液盖过胶面约～，加盖避光，置于℃～.使充分解旋.碱性条件下（>）可使展开、解旋为单链，碱性易变性区段() 变为单链断片( ) .文档来自于网络搜索.电泳解旋结束后，通电电泳.电泳条件为和，电泳～.或按～确定电压.最适条件实验者可自行选择.最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够地敏感性并减少实验室间差异.文档来自于网络搜索.中和与染色电泳后取出载玻片，在缓冲液（）中浸没或漂洗次，每次.每张胶板上滴加～µ荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤.以上各步骤应在黄或红光下操作.中和后地凝胶片应在内染色，以免过多扩散.否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水左右，或在室温中晾干.对于干燥地凝胶片，使用中性缓冲地甲醛处理数分钟，将有利于长期保存.文档来自于网络搜索.结果观察结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式.在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大～倍)，每片记数～个细胞，每个剂量组检查个细胞.无损伤地细胞表现为一圆形荧光细胞核.受损地细胞所产生地断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”地慧星现象.文档来自于网络搜索镜下观察时，首先应记录出现拖尾地细胞数，计算拖尾细胞率.同时用目镜测量拖尾细胞地尾长，统计各试验（剂量）组地平均尾长.尾长是指断片从其主核向电泳正极迁移地距离，而不同地实验室尾长测定方法有所不同.但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较.文档来自于网络搜索图象分析需有相应地设备和专门地分析软件.使用电脑逐个对细胞进行图像分析.应用图像分析系统可得到更多地分析参数.目前主要观察指标有尾长（）、慧尾地百分含量、尾距（）、尾块( )和尾惯量（）等.尾长( )即迁移地长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块( )即彗星尾部分散地大小不一地断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块地面积、平均荧光强度、在轴上与彗核中心距离有关地综合性指标.目前通常选用迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标.文档来自于网络搜索目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国公司地、美国公司地()、德国公司地分析系统、捷克公司地彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部地百分比、碎片等.但这些软件均需与其相应地仪器设备配套使用，价格十分昂贵.国内也正在开发一些分析系统.文档来自于网络搜索除了昂贵地商业软件外，也有一些免费地彗星分析软件.如等所设计地分析软件( ) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部含量、尾矩等多项参数. 等在地基础上研制了另一软件()，该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量地彗星参数中增加了尾矩，而且用户界面更友好.这个免费软件地一个特点是，它们地源代码是公开地，人们可以看到每一个彗星参数地运算方法和编写程序.因此，软件使用者可以根据实验目地地不同来改变这些参数地运算方法和计算程序，从而建立一个新地测量遗传损伤地参数.这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算试验菌落数以及电泳凝胶地分析等.年建立了免费下载系统，其网址为：和.近年来使用较多地国外免费分析软件见以下网址：；文档来自于网络搜索.随着彗星试验地发展，在资源共享地网络空间里，会有更完善更方便地彗星分析软件出现.文档来自于网络搜索（五）注意事项虽然具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素地影响而难以得到理想地实验结果.下面是几点注意事项..单细胞悬浮液地制备：最好将细胞数目调至约×个.如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面地细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析.文档来自于网络搜索.制片：目前制片地方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶.制片总地原则是: 获得牢固稳定凝胶地同时，避免额外地损伤与修复.文档来自于网络搜索.电泳条件：一般选用低电压和短时间.电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测地灵敏度，但也会使正常地细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果.文档来自于网络搜索.实验条件：整个实验过程需在低温(约℃) 和暗光下进行，避免额外地损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果地产生.文档来自于网络搜索.与凋亡细胞断片地区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适地试验条件地影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量断片，也会在电泳以后出现拖尾.由于它们与常见断裂剂诱导地损伤在形成机制、生物学和毒理学上地意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果地干扰.在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通链断裂损伤细胞地差异主要是：①在彗星形态上，凋亡细胞地断片彗星头很小，头长不超过µ，仅由核内不能裂解地与蛋白质框架相连地片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径地比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带.而普通链断裂，彗星头直径一般都大于µ，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端地延伸形成，它地另一端仍与主核相连.②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞地断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加.而链断裂损伤地剂量反应关系表现为彗星尾长地增加.文档来自于网络搜索（沈孝兵，浦跃朴）。
Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
单细胞凝胶电泳技术研究兔牙髓细胞核DNA降解的时间效应李晓娜1，杨泽礼2，郑吉龙3，纪伟1（1.中国医科大学 基础医学院，辽宁 沈阳 110001；2. 中国医科大学 教务处，辽宁 沈阳 110001；3.中国刑警学院 法医学系，辽宁 沈阳 110035）摘要：目的 研究DNA降解变化与死亡时间关系，探讨兔死后牙髓细胞核DNA的降解机理及寻找灵敏、实用的DNA降解监测指标，为死亡时间的法医学研究提供一种新的方法和技术。
方法 利用快速、灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳(SCG)技术结合荧光显微镜和专业的计算机图像分析技术，以“彗星样”细胞出现率(计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例)、头半径、尾长度、头/尾DNA含量比例、Oliver矩、尾矩、头面积和尾面积来评价死后兔牙髓细胞核DNA的降解程度。
结果 在个体死亡72h内，测定的8项参数指标中尾DNA含量比例、彗星尾长、尾矩、Olive矩、尾面积都呈增加趋势，头半径，头DNA含量比例，头面积均呈下降趋势。
上述参数均与死亡时间具有高度的相关性。
并将每个参数的测量值进行了多项式运算，获得了更能体现DNA降解趋势的二项式回归方程（P ＜0.001）,具有显著的统计学意义。
结论 应用单细胞凝胶电泳技术，监测机体死后牙髓细胞核DNA降解变化，将会成为推断死亡时间精确、客观的新方法。
关键词：单细胞凝胶电泳；死后间隔时间；DNA降解中图分类号：R 329.28 文献标识码：AA study on the postmortem course of DNA degradation of dental pumpcells in rabbits by Single-cell gel electrophoresisLI Xiao-na1,YANG Ze-li2,ZHENG Ji-long3,et al(1.China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001;2.China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001;3.China Criminal Police College Institute,Shenyang,Liaoning 110035)Abstract:【Objective】To study changes of DNA degradation in the cellule of rabbits and relationship with the postmortem interval.，To search the rule of DNA degradation ，and find a new method and technique to estimate the postmortem interval. 【Methods】DNA degradation was measured by single-cell gel electrophoresis （SCGE）and fluorescent microscope connected with auto-analysis-image system. The degree of DNA degradation was judged by the percentage of cells with comet-like tail，the tail length ，the head radius， the percentage of head DNA，the percentage of tail DNA，tail moment，Oliver moment，the head area and tail area of the cells. 【Resluts】The tail length，the head radius，the percentage of head DNA，the percentage of tail DNA，the tail moment，the olive moment，the head area and tail area all change greatly with the extension of postmortem interval，which indicate the degradation rate and degree of DNA in the nuclear has a close relationship with postmortem interval from 0 to 72h postmortem in rabbits and get regress equation and statistic meaning（P <0.001）.【Conclusion】Determine the quantity of DNA degradation in nuclear by single-cell gel electrophoresis should be an objective and exact way to estimate the PMI.Key words:single cell gel electrophoresis;postmortem interval;DNA degradation死亡时间(Postmortem Interval,PMI)的推断一直是法医学领域最重要且复杂的课题。
单细胞凝胶电泳检测酞酸酯类对DNA的损伤赵文红;厉曙光;石红军【期刊名称】《中国公共卫生》【年(卷),期】2004(20)10【摘要】目的应用单细胞凝胶电泳 (SCGE)技术对增塑剂 (DEHP)邻苯二甲酸二乙基己酯致小鼠胚胎成纤维细胞 (3T6细胞 )DNA损伤、损伤程度以及有无剂量 -效应关系进行检测。
方法将溶剂二甲基亚砜处理的 3T6细胞作为阴性对照组 ,用H2 O2 染毒的 3T6细胞作为阳性对照组(80 μmol/LH2 O2 染毒 ) ,将不同浓度DEHP处理的 3T6细胞设为 4个剂量组(6 2 5 ,12 5 ,2 5 0 ,5 0 0 μg/ml)进行SCGE检验。
结果各染毒组细胞DNA损伤与阴性对照组比较 ,均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;且随DEHP染毒浓度增加 ,3T6细胞DNA损伤程度加重 ,有剂量 -效应关系。
结论DEHP体外染毒对 3T6细胞能造成损伤。
【总页数】2页(P1164-1165)【关键词】DEHP;单细胞凝胶电泳;小鼠胚胎成纤维细胞;DNA损伤【作者】赵文红;厉曙光;石红军【作者单位】蚌埠医学院预防医学系;同济大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.自制单细胞凝胶电泳玻片用于检测细胞DNA损伤 [J], 朱进;阳东荣;单玉喜2.单细胞凝胶电泳检测非小细胞肺癌患者淋巴细胞DNA损伤 [J], 宋娜娜;黄宏君;吴白平;邓爽;熊志敏;徐克前3.单细胞凝胶电泳技术检测丙烯酰胺亚急性中毒大鼠的单细胞DNA损伤 [J], 杨淑芸;李国良;付正英;张引国;张金波4.单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤 [J], 杨建一;彭芸;李莉5.单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤 [J], 陈安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
2.原理介绍有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着于核基质中,当细胞被琼脂糖包埋时，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其它成分即进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍维持其环区附着于核骨架上，位置未发生迁移。
当细胞为受损伤时，核DNA因分子量大，荧光染色后可呈现圆形荧光团，无拖尾现象。
但在DNA单链有断裂时，由于碱性电泳液可使DNA双链解螺旋并碱变性为单链，此时单链断裂的碎片由于分子量小，即可进入凝胶中，在电泳时离开核基质向阳极迁移形成拖尾，形似彗尾。
且拖尾愈长，在相同电泳条件下，表示受损的断片越多，断片也愈小，即为核DNA受损越重【13】。
通过测定DNA迁移的部分的光密度或迁移长度就可以测定DNA损伤程度，从而确定作用因素的剂量与损伤效应间的关系。
3.操作程序【10】3.1 凝胶的制备：准备0.5%的低融点琼脂糖和0.5%的正常融点琼脂糖（以无Ca2＋、Mg2＋的PBS溶液配制）。
将90ul的正常融点的琼脂糖加到4℃的载玻片上，并立即加盖玻片，待胶凝固后，移下盖玻片，加入75ul混有1000个/10ul细胞的低融点琼脂糖，盖上盖玻片，将玻片放入4℃冰箱内使胶迅速凝固，取下盖玻片，加上75ul低融点的琼脂糖作为第三层。
再盖上盖玻片，放入冰箱中，以上操作均在黄光下进行，以防止DNA损伤。
有关凝胶的制备在不同文献中方法有所差异，Schmezer【11】等曾有报道在玻片上预铺0.5ml 正常融点的琼脂后再待其凝固，刮净后进行以上操作可增强第二、三层胶的附着性。
另外在琼脂糖的加入量上个实验室亦有所不同，有待统一化。
3.2 细胞的处理实验所需细胞悬液可由细胞培养或组织活检样品中获得，在加到凝胶中应达到（1～5）×10（4～6）/ml的细胞密度。
通常以胎盼蓝拒染法测定。
细胞存活率在95%以上者留用。
由于胰酶消化及刮片等机械性分离亦有可能引起DNA损伤，故Singh【12】等推荐在玻片上贴壁培养单层细胞直接供测试用。
根据不同实验目的，加受试物于培养液中。
3.3细胞的裂解移去3.1 中的盖玻片，将胶板浸于新配制的预冷的4℃细胞裂解液中至少1h（宜放于4℃冰箱中，裂解液成分为2.5mol/L NaCl, 100mmol/L NaEDTA, 10mmol/L Tris－HCl,pH 10.0和1%肌氨酸钠，用前加1%Triton 和10%的DMSO）.3.4DNA展开、电泳轻轻取出裂解后玻片置于水平电泳槽内阳极端附近，玻片间不留空隙，用新配制的电泳液（含300mmol/L NaOH和1mmol/L Na2EDTA）完全盖过胶面。
勿在凝胶上产生气泡。
静置20min，待DNA充分展开后电泳（25V, 300mA）, 时间约20min。
3.5 中和、染色电泳后取出玻片，用缓冲液（0.4mol/L Tris－HCl, pH7.5）将胶板浸没15min（以防碱液或去污剂干扰染色）或滴洗3次，每次5min。
然后染色2～20min，以蒸馏水洗涤后尽快阅片（此步以上在黄光下进行，宜24h内阅片）。
3.5阅片、分析放大250×于荧光显微镜下观察电泳图像，每片计数50个细胞，每组5张玻片。
4.影响SCGE结果的试验因素4.1 染毒方式对于DNA的损伤，有时需区分其为直接的DNA损伤及所致还是由在体内代谢活化后形成的间接损伤剂造成，Kasamatsu【14】提出一个SCGE的改进方案，使细胞在玻片上裂解后再行染毒，与常规方法相比，即可有效实现上述目的。
另一方面，传统染毒方式对培养瓶的细胞而言，一个培养瓶的细胞只能做一个染毒浓度，造成大规模检测时的不便。
因此，近年来又提出采用玻片上染毒的改良彗星试验，据称对SCGE的灵敏度有很大提高（约10倍），同时节约人力、时间等【15】。
4.2 裂解时间如前所述，裂解时间目前至少应为1h，为探讨能否通过延长裂解时间已解决诸如因停电而被迫终止裂解等问题，有人通过平行对照分析了裂解时间的影响后发现，低于0.5h裂解时间时，低剂量DNA损伤剂即不能很好检出；而裂解时间超过24h，高剂量组DNA迁移不再增加而对照组细胞却出现明显迁移【16】。
可见，裂解时间在1h以上是合适的。
4.3 电泳液成分由SCGE的原理可知，电泳的同时，还需将双链DNA解螺旋变性，因此电泳液的PH 值对SCGE的结果影甚大，Klaude[17]等，曾对不同浓度NaOH的电泳液进行研究发现，为提高SCGE的灵敏度，可以提高电泳液NaOH的浓度，也可以通过加入NaCL以加速DNA 碎片的分离。
适宜的NaOH浓度应在0.03mol/L左右，并加0.27mol/L NaCL。
4.4 电泳时间电泳时间对DNA迁移影响也较大，Vijayalxmi[18]等研究发现，电泳时间在30分时，对照组基本不发生迁移，而受试组均有明显DNA迁移并有较好的剂量-效应关系，电泳时间延长时，DNA迁移的增加在低剂量组更明显，导致对照组均出现迁移同时受试物组DNA 迁移长度亦渐趋稳定而无法辨别。
5.前景展望SCGE技术对检测单细胞DNA损伤具有许多优点，在国外已应用于多个领域[19-20]，其广阔的应用前景无可非议，方法学上的改进，标准化也正方兴未艾，相信这一技术在我国将得到推广应用。
SCGE技术也存在一些尚待改进的不足之处，需测定其对不同毒物的检测阈，还需突破SCGE对荧光显微镜的依赖等。
随着研究工作的进一步展开，诚如Mckelvey[1]所言，本方法必将在各个应用领域发挥出其潜在价值。
参考文献1、Mckelvey-Martin VJ,Green MHL,Schmezer,et al. The single cell gel electrophoresis assay(Comet assay)：AEuropean review. Mutat Res,1993,288：47-63。
2、Fairba irn DW,Olive PL,O’Neill KL. The comet assay：a comprehensive review.Mutat Res,1995,339：37-59。
3、衡正昌，张遵真。
二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究。
卫生毒理学杂志，1997,11：87-89。
4、王民生，Schmezer P 。
碱性单细胞微板凝胶电泳测试技术简介。
癌变畸变突变，1996,8(2)：112-115。
5、张遵真，衡正昌。
用单细胞凝胶电泳技术检测铬和砷化物的损伤作用。
中华预防医学杂志，1997,31：365-367。
6、罗瑛，孙志贤，杨志彪等。
辐射后单个细胞DNA结构变化的定量检测。
生物化学与生物物理进展，1994,21：451-453。
7、Olive PL, Banath J P and Durand R. Radiation Res,1990,122：86-94。
8、Lett JJ et al. A new method for detection of mutagens. Biophys J,1970,10：227-284.9、Kohn KW. Fractionation of DNA fron mammalian cells by alkaline elution.Biochemistry,1976,156：4629-4637.10、Tice RR, Strauss GHS, Peters W P. Mutat Res, 1992, 271:101-113.11、Schmezer P, Eckert C, Liegibel UM. Tissue-specific induction of mutation by streptozotocin in vivo . MutatRes, 1994;307: 495-499.12、Singh NP, Tice RR,Stephens RE, et al. Mutat Res,1991;307:495-499.13、张慧丽，余卫，阎长会. 单细胞凝胶电泳技术在军事毒理学中的应用. 卫生毒理学杂志.1999，13（3）：182-184.14、Kasamatsu T, Kohda K and Kawazoe Y. Comparison of chemically induced DNA breakage in cellular andsubcellular systems using the comet assay. Mutat Res, 1996,369:1-6.15、张遵真，衡正昌，王涛. 改良的彗星实验与标准方法的对比研究. 卫生毒理学杂志，2000，14（3）：180-182.16、张遵真，衡正昌，李蕊等. 单细胞凝胶电泳试验的最适条件研究. 卫生毒理学杂志，1998，12（4）：249-251.17、Klaude M. Mutat Res, 1996,363:89-96.18、Vijayalxmi, Tice RR and Strauss GHS, Mutat Res, 1992, 271: 243-252.19、Moretti M, Villarini M, Scassellatti Sforzolini G , et al. Extet of DNA damage in density-separated trouterythro cytes assessed by the ‘comet’ assay. Mutat Res, 1998,397:353-360.20、Stefan O Muller , Inge Eckert . Werner K. Lutz, Helga Stopper. Genotoxicity of the laxa-tive drug componentsemodin, aloe-emodin and danthron in mammalian cells: Topoisomerase Ⅱmediated? Mutat Res, 1996,371:165-173.。
