芝麻子叶基因转化受体系统的建立

分子植物育种，２０１１年，第９卷，第６期，第７７０—７７８页　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０１　１，Ｖｏ１．９，Ｎｏ．６，７７０—７７８　研究报告　Ａ　Ｌｅｔｔｅｒ　芝麻子叶基因转化受体系统的建立　魏利斌马琴琚铭张体德王慧丽苗红梅　河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州，４５０００２　通讯作者，ｍｉａｏｈｏｎｇｍｅｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ　摘要试验以芝麻栽培种豫芝ｌ　１号为材料，对子叶丛生芽诱导及植株再生体系以及子叶受体材料对卡那　霉素、潮霉素和头孢霉素的天然耐性进行了研究，建立了芝麻子叶基因高频转化受体系统。结果表明，适宜　的诱芽培养基为ＭＳ＋５．０　ｍｇ／Ｌ　６一ＢＡ＋１．０　ｍｇ／Ｌ　ＩＡＡ＋５．０　ｍｇ／Ｌ　ＡｇＮＯ３＋１．０　ｍｇ／Ｌ　ＡＢＡ＋３％蔗糖＋０．８％琼脂；　６一ＢＡ对子叶膨大起决定作用，ＡＢＡ、ＩＡＡ则是诱导丛生芽高频发生的关键因子，ＡｇＮＯ　对丛生芽发生有显　著的促进作用。在芝麻子叶膨大出芽期、芽增殖期及试管苗生根期等遗传转化的三个重要时期，适宜的卡那　霉素筛选浓度分别为７０　ｍｇ／Ｌ、７０　ｍｇ／Ｌ、２０　ｍｇ／Ｌ，潮霉素筛选浓度分别为４０　ｍｇ／Ｌ、６０　ｍｇ／Ｌ、１０　ｍｇ／Ｌ。在农　杆菌介导的芝麻遗传转化中，头孢霉素使用浓度以５００　ｍｇ／Ｌ为宜，抑菌效果好且不影响转化受体生长。　关键词芝麻，子叶，受体系统　Ｅｓｔａｂｆｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　Ａｃｃｅｐｔ　ｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｅｓａｍｅ　ｓ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ＷｅｉＬｉｂｉｎ　ＭａＱｉｎ　ＪｕＭｉｎｇ　ＺｈａｎｇＴｉｄｅ　ＷａｎｇＨｕｉｌｉ　ＭｉａｏＨｏｎｇｍｅｉ’　Ｈｅｎａｎｎ羽　ｓ｜嘴蛐　Ｒｅ，ｅａｒｔｈＣ即溉Ｈ蚺哺Ａｃａｄｅｍｙｏｆｋｇｒｉｅａｌｔｕｒａｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，４５０００２　‘￣ｉａ￣ａｕｌｈａｒ，ｍｉａｏｋ　ＤＯ／：１０．３９６９ｈｎｐｂ．００９．０００７７０　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｍ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｓａｍｅ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ，ｐｅｒｆｅｃｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｓｅｓａｍｅ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｎｄｕｒａｎｃｅｐｏｉｎｔｓｏｆｅｘｐｌａｎｔｓａｎｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ０ｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ，ｉ．ｅ．，Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄＣｅｆｏｔａｘｉｍｅ，ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｄｅ印ｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ＭＳ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５．０　ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ，　１．０　ｍｅｒｌＥ　ＩＡ　５．０　ｍｇ／Ｌ　ＡｇＮＯ　１．０　ｍｇ／Ｌ　ＡＢＡ，３％ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｎｄ　０．８％ａｇａｒ．６－ＢＡ　ｗｏｕｌｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｂｅｉｎｇ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＢＡ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｈｉ　ｇｈ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ＡｇＮ０３　ｃｏｕｌｄ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｈｏｏｔｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｕｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔ　ｒｏｏｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ，ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ａｒｅ　７０　ｍｇ／Ｌ，７０　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　２０　ｍｇ／Ｌ，Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ａｒｅ　４０　ｍｇ／Ｌ，６０　ｍｇ／Ｌ，１０　ｍｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ　Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，５００　ｍｇ／Ｌ　Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｈｏｓｅｎ，ｂｙ　ｗｈｉｃｈ　Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｗｈｅｎ　ｎｅｅｄｅｄ，ｙｅｔ　ｓｅｓａｍｅ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗｏｕｌｄ　ｎｏｔ　ｉｍｐａｉｒｅｄ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｓｅｓａｍｅ　ＳｅｓＯ，ＩＦｔｌｚｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．），Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ，Ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ　芝麻Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）属胡麻科芝麻属，是世　界上古老的优质油料作物之一（Ａｓｌｌｒｉ，１９９８）。我国芝　麻年种植面积８．０ｘｌ０　ｈｍ　左右，总产量约７５ｘ１０　ｔ，　居世界第一位，在国际芝麻贸易中具有重要的地位。　目前，生产上应用的芝麻品种均来自于仅有的一个栽　培种，遗传基础狭窄，生产中仍然存在抗病耐渍性差、　产量低而不稳等急需解决的问题（张海洋等，２００７，全　国芝麻和特油作物产业发展暨学术研讨会论文汇编，　ＰＰ．９—１８），而转基因技术的迅速发展为作物抗病抗逆　等性状的改良提供了新途径，高效稳定且再生能力强　基金项目：本研究由现代农业产业技术体系建设项Ｎ（ＣＡＲＳ一１５）和河南省科技攻关项目课题（１０２１０２１１０１４８）

共同资助　７７　…　ｇ　的受体系统是实现作物基因转化的先决条件（王关林　和方宏筠，１９９８）。近年来，以芝麻子叶为外植体的芝　麻组织培养及再生技术研究已报道较多。研究表明　以种子、子叶等为外植体可成功诱导出丛生芽（陈占　宽等，１９９４，河南农业科学，ｌ１：１０．１２；郅玉宝等，１９９８，　信阳农业高等专科学校学报，８（３）：１２—１５；Ｓｈａｒｍａ　ａｎｄ　Ｐａｒｅｅｋ，１９９８），但丛生芽发生频率有所不同。Ｒａｏ和　Ｖｉａｄｙａｎａｔｈ（１９９７）以不同基因型芝麻茎尖作为外植　体直接诱导出丛生芽，最高诱导率达８５％～１００％；　Ｙｏｕｎｇｈｅｅ（２００１）从子叶直接诱导出了丛生芽，但发　生频率仅为１Ｏ％；而Ｔａｓｋｉｎ和Ｔｕｒｇｕｔ（１９９７）以子叶　为外植体没有获得再生苗。也有研究报道从子叶外　植体可诱导愈伤组织并分化出苗（李宝平等，１９９０；　易永华等，１　９９７；Ｗｅｒｅ　ｅｔ　ａ１．，２００６），分化频率变化幅　度在１０％～６３％。本实验室也对芝麻子叶丛生芽诱导　技术体系开展了优化研究（安建伟，２０１　１，私人通讯）。　但迄今为止，国内外尚未建立适用于农杆菌介导转　化的高频芝麻遗传转化及受体筛选系统。为此本试　验以豫芝１１号为试验材料，对子叶丛生芽诱导及植　株再生培养基类型以及子叶丛生芽不同发育阶段对　卡那霉素Ｋｍ、潮霉素Ｈｙｇ和头孢霉素Ｃｃｆ的天然耐　性进行了研究，建立了芝麻子叶的基因高频转化受　体系统，为进一步开展芝麻农杆菌介导的遗传转化　奠定了良好基础。　１结果与分析　１．１芝麻子叶最佳诱芽培养基的筛选　在本实验室以往研究结果的基础上（安建伟等，　２０１　１），本试验对芝麻子叶诱芽有重要影响的６－ＢＡ、　ＩＡＡ、ＡＢＡ等激素及ＡｇＮＯ，添加物的最佳浓度及复　配比例进行了研究（表１）。　从表１可以看出，在不添加６－ＢＡ时，子叶膨大　率为０；添加２．５～１０．０　ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ后，Ｔ２－２０处理　的子叶膨大率达到９５％～１００％，且处理间差异不明　显，说明６－ＢＡ添加与否决定了芝麻子叶能否正常　膨大脱分化；而ＡＢＡ、ＩＡＡ的有无对子叶膨大几乎没　有影响。因此，在进行下一步丛生芽诱导时，试验选　表１不同激素类型及配比对芝麻子叶诱芽的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｈｏｒｍｏｎｅ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂｕｄｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｓａｍｅ　ｃｏｔｙ　ｌｅｄｏｎｓ　处理　激素浓度（ｍ　Ｌ）　外植体数　膨大数　膨大率（％）出芽数　出芽率（％）　不定芽长势　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ｎｏ．ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　Ｎｏ．ｏｆ　ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｎｏ．ｏｆｂｕｄ　Ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｄ　ｇｒｏｗｔｈ　（ｍ　Ｌ）　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｒａｔｅ（％）　ｒａｔｅ（％）　ｓｔａｍｓ　６－ＢＡ　ＩＡＡ　ＡＢＡ　ＡｇＮＯ３　

注：＋＋＋：苗生长极好；＋＋：苗生长较好；＋：苗生长一般；一：苗生长差　Ｎｏｔｅ：＋＋＋：Ｂｅｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ；＋＋：Ｂｅｔｔｅｒ　ｇｒｏｗｔｈ；＋：Ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔｈ；一：Ｓｌｏｗ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｒ　ｎｏ　ｇｒ

ｏｗｔｈ　７７ｓ　ｄ　

使用浓度（图２Ｃ），此时非遗传转化外植体的出芽率　较低或接近于零。　１．２．２遗传转化幼苗期Ｋｍ、Ｈｙｇ耐受临界浓度的筛选　切取２～３　ｃｍ的子叶诱导丛生芽苗，接种在ＭＳ＋　２．０　ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋２．５　ｍｇ／Ｌ　ＡｇＮＯ３幼苗培养基上，附加　０￣１００　ｍｇ／Ｌ　Ｋｍ或０￣１００　ｍｇ／Ｌ　Ｈｙｇ，３０　ｄ后统计，得　到结果如表４和表５。　由表４、表５可以看出，当卡那霉素浓度为８０　ｍｇ／Ｌ　时，幼苗生长完全受抑，随着培养时间的延长，逐渐　枯黄死亡；在亚致死浓度（７０　ｍｇ／Ｉ３时，芽增殖率为　１０．７１％，但因长势太差，植株生长不正常（图２Ｅ）。当　潮霉素浓度达到７０　ｍｇ／Ｌ，幼芽生长才完全受到抑　制。浓度为６０　ｍｇ／Ｌ时，幼芽增殖率为２０％，但植株　生长状况较差（图２Ｆ）。以上结果表明，在丛生芽培养　及繁殖期，芝麻幼芽盘块对卡那霉素及潮霉素有一　定的耐受性，且与子叶诱芽期的耐受程度相当或稍　

高。因此，在对幼苗期的芝麻转基因材料进行筛选培　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　Ａｃｃｅｐｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｅｓａｍｅ（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ．）Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　‘。　芝麻子叶基因转化受体系统的建立　…　

Ｈｙｇ　ｃｏｎｃｅｎｕａｔｉｏｎ　接种数　新增苗数　苗增殖率　）　苗均高（ｃｍ）　苗长势　Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　Ｎｏ．ｏｆｎｅｗ　Ｓｈｏｏｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｈｅｉｇｈｔ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｌｅｔ　ｇｒｏｗｔｈ　（ｍｇ／Ｌ）ｐｈａｆｌｅｔｓ　ｓｈｏｏｔｓ　ｒａｔｅ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ（ｃｍ）　ｓｔａｔｕｓ