目的基因导入受体细胞

第2节基因工程的基本操作程序（第2课时）◆教学目标1．列举将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法。

2．列举检测与鉴定目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达其遗传特性的方法。

3．能够用流程图的形式概括出基因工程的操作程序。

4．针对人类生产或生活中的某一需求，能运用基因工程技术尝试设计并获得某一转基因产品的方案。

◆教学重难点【教学重点】1．将目的基因导入受体细胞的方法。

2．目的基因的监测与鉴定。

【教学难点】农杆菌转化法。

◆教学过程【新课引入】教师展示资料：研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。

【学生活动】阅读上述资料，思考抗冻番茄培育过程中的目的基因和运载体分别是什么？（抗冻蛋白基因afp，Ti质粒）如何构建基因表达载体？（学生复习上一节课的内容）重组Ti质粒侵染番茄细胞属于基因工程中的哪一步操作？（将目的基因导入受体细胞）如何检测才能证明转基因抗冻番茄转化成功呢？【过渡】先来认识什么是转化呢？【新知讲解】一、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

【教师活动】引导学生思考，根据生物学知识，受体细胞可能有哪些种类？提示：（1）植物细胞——体细胞或受精卵（植物容易诱导全能性表达）（2）动物细胞——受精卵（全能性最高）（3）微生物细胞——大肠杆菌（使用最广泛）（一）将目的基因导入植物细胞【教师活动】教师结合植物花的结构讲授花粉管通道法，并向学生阐述，“花粉管通道法”是我国科学家独创的一种方法，增强学生的民族自信心。

1．花粉管通道法方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

方法二：在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。

2．农杆菌转化法【学生活动】学生自主阅读教材81页资料卡中“农杆菌转化法”的内容，思考为什么选择农杆菌？它具有的怎样的优势？“农杆菌转化法”操作流程是怎样的？提示：可侵染植物细胞；具有T-DNA。

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A 棉花细胞花粉管通道法B 大肠杆菌农杆菌转化法C 羊受精卵显微注射技术D 小麦细胞基因枪法答案 B解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。

2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上B．受体细胞染色体的DNA上C．T-DNAD．农杆菌的拟核答案 B解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。

3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是()A．显微注射法B．农杆菌转化法C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。

4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是()A．目的基因的提取和导入B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的表达答案 C解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。

5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是()A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少，易操作D．性状稳定，变异少答案 B解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。

第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定[学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。

2.了解农杆菌转化法。

3.画出DNA 分子杂交示意图。

4.目的基因的检测方法的比较。

知识点一 将目的基因导入受体细胞知识梳理1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。

2．将目的基因导入植物细胞(1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti 质料上的T －DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA 上。

②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。

③操作过程：将目的基因插入到□07Ti 质粒的T­DNA 上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA 上―→目的基因表达。

(2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。

是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA 打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。

(3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。

该方法十分简单经济。

我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。

3．将目的基因导入动物细胞(1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。

(2)受体细胞：动物的□02受精卵。

(3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。

4．将目的基因导入微生物细胞(1)方法01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细①用□胞称为□02感受态细胞)。

二将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定一、将目的基因导入受体细胞1．转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．将目的基因导入植物细胞的方法3．将目的基因导入动物受精卵的方法：利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。

4．将目的基因导入微生物细胞的方法：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。

先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。

[提醒]微生物(大肠杆菌、酵母菌等)具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。

二、目的基因的检测与鉴定[提醒]PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。

(1)将目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。

()(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。

()(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。

()(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。

()(5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。

()(6)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中，可用抗原—抗体杂交技术。

()答案：(1)√(2)×(3)×(4)×(5)√(6)×知识点一将目的基因导入受体细胞1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。

第一次导入是将含目的基因的Ti质粒转入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

2．受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。

(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。

第8课时目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。

2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。

[核心素养] 1.科学思维：结合生产实际，举例说出基因工程的基本程序。

2.社会责任：针对生产生活中的某一需求，尝试提出基因工程构想，完成初步设计。

一、将目的基因导入受体细胞1.转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。

a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。

b.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。

②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。

表达载体DNA包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。

③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

(2)导入动物细胞①方法：显微注射技术。

②常用受体细胞：受精卵。

③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期培养→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的转基因动物。

(3)导入微生物细胞①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

②常用的方法a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。

b.感受态细胞和重组表达载体DNA分子在缓冲液中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。

1.将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？提示大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。

1．2.2目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。

2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。

方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。

在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。

方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

这是基因工程的第四步工作。

在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。

因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。

检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

一、将目的基因导入受体细胞1．转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。

a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。

b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。

②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。

目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。

③花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

基因工程的应用必备知识基础练1.科学家已能运用基因工程技术,让羊的乳腺合成并分泌人体的某些抗体,以下叙述不正确的是()A.该技术可导致定向变异B.表达载体中需要加入乳腺蛋白基因的特异性启动子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受体细胞,将目的基因导入受体细胞,可以定向改变生物性状,A项正确;运用基因工程技术,让羊的乳腺生产抗体,则表达载体中目的基因上游要加入羊乳腺蛋白基因的启动子,B项正确;目的基因是人体内控制某些抗体合成的基因,C项错误;受精卵常作为动物基因工程的受体细胞,D项正确。

2.下列关于培育转基因抗虫棉的叙述,正确的是()A.DNA连接酶能把Bt抗虫蛋白基因与噬菌体相连接B.Bt抗虫蛋白基因可借助花粉管通道进入受体细胞C.Bt 抗虫蛋白对害虫和人都有不同程度的毒害作用D.需制备好相应抗原来检测 Bt 抗虫蛋白,可用DNA连接酶将编码Bt 抗虫蛋白的基因与农杆菌的Ti 质粒相连接,构建基因表达载体,A项错误;在植物细胞基因工程中,可利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞,也可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中,B项正确;Bt 抗虫蛋白对哺乳动物无毒害作用,C项错误;要检测目的基因是否成功翻译,可用抗原—抗体杂交技术进行检测,目的基因翻译的蛋白质作为抗原,故需制备好相应抗体来检测Bt 抗虫蛋白,D项错误。

3.将某病毒的外壳蛋白(L1)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接,构建L1-GFP融合基因,再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。

图中限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同。

下列叙述错误的是()A.构建L1-GFP融合基因需要用到限制酶有E1、E2、E4B.E1、E4双酶切确保L1-GFP融合基因与载体的正确连接C.若受体细胞中观察到了绿色荧光,说明L1基因已经表达D.培育乳汁中含L1的转基因羊需将表达载体转入乳腺细胞L1-GFP融合基因需要先用限制酶处理获得L1基因和GFP基因,并将二者连接,故需要用到E1、E2、E4三种酶,A项正确;根据题意,限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同,E1、E4双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接,保证L1-GFP融合基因与载体准确连接,B项正确;GFP基因可以认为是标记基因,表达出的绿色荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,利用这一特性可用于检测细胞中目的基因是否表达,C项正确;为了获得L1蛋白,可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞中,用于培育乳汁中含有L1蛋白的转基因羊,D项错误。

目的基因（COR）转入受体细胞的方法及检测学生：魏烈斌指导老师：高海宁(河西学院农业与生物技术学院甘肃张掖734000）摘要：利用PGEM—T -easy质粒为载体，用CaCl2法制备感受态细胞，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导COR基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的选择培养基筛选出含有抗氨苄青霉素基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌用碱裂解法进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切凝胶电泳图的分析。

用EcoRI酶进行酶切研究。

结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中跟随质粒的复制进行同步复制并通过大肠杆菌自身的表达系统表达出了抗氨苄青霉素的产物，使大肠杆菌能在含氨苄青霉素的LB培养基上正常生长。

关键字： PGEM--Teasy质粒抗氨苄青霉素氯化钙法大肠杆菌引言：在DNA体外重组技术的研究和应用中，转化是个很重要的步骤。

自Cohen等人在1972年首次用CaCl2：处理的方法成功地进行了R因子对E. colt C600的转化之后，这个方法一直广泛地应用于大肠杆菌各受体菌系的转化。

鼠伤寒沙门氏杆菌S. typhimurium和金黄色葡萄球菌S. aureus，的转化也都沿用此法。

直至1978年，Michael等在用pBR 322质粒DNA对E. colt X1776的转化中却采用了与此不同的方法。

1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM--Teasy质粒 Taq酶1.1.2 仪器：基因扩增仪移液器电泳仪紫外检测仪恒温摇床恒温水浴器恒温培养箱低温离心机超净工作台冰箱离心管小指管1.1.3 试剂： PCR缓冲液(含Mg@+) 4种dNTP Taq酶 DNA模板两种引物（正向引物和反向引物） EB溶液氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素氯化钙(CaCl2) 酒精灯牙签 LB液体培养基 ddH2O 溶液Ⅰ（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合溶液Ⅲ 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。