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第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选案例

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第六章 重组DNA导入受体细胞

第六章 重组DNA导入受体细胞

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

基因片段与载体连接、转化和重组子筛选

基因片段与载体连接、转化和重组子筛选

1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？

2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法


菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提

目的基因导入受体细胞

目的基因导入受体细胞

（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。

重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法

基因工程作业(引物设计)讲解

基因工程作业(引物设计)讲解

口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。

方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。

结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。

结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。

二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。

重组子筛选与鉴定

重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。

高中生物专题1基因工程1.2第2课时将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定教案高二生物教案

第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定[学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。

2.了解农杆菌转化法。

3.画出DNA 分子杂交示意图。

4.目的基因的检测方法的比较。

知识点一 将目的基因导入受体细胞知识梳理1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。

2．将目的基因导入植物细胞(1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti 质料上的T －DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA 上。

②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。

③操作过程：将目的基因插入到□07Ti 质粒的T­DNA 上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA 上―→目的基因表达。

(2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。

是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA 打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。

(3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。

该方法十分简单经济。

我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。

3．将目的基因导入动物细胞(1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。

(2)受体细胞：动物的□02受精卵。

(3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。

4．将目的基因导入微生物细胞(1)方法01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细①用□胞称为□02感受态细胞)。

重组基因导入受体细胞优秀课件

重组基因导入受体细胞优秀课件
体外标记
• 包括化学法和酶法两种。 • 化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种
基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探 针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制 备非放射性标记物的探针。 • 常用的化学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和 交叉相连法等。 • 酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促 聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸 探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部 分非放射性标记探针。 • 常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记 法、DNA末端标记法及PCR标记法等。
重组基因导入受体细胞优秀课件
• 它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝 胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
重组基因导入受体细胞优秀课件
• 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在 固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交， 在与探针有同源序列的固相DNA的位置上 显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判 断被检测的DNA样品中是否有与探针同源 的片段以及该片段的长度。
• Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从 电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法．又称 为Northern RNA印迹杂交等。
• 该法是在Southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对 RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但 RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处 理。
• 随机引物：46 • 使用随机引物标记的探针一般长400-600个
核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。 与切口平移法不同的是，该方法标记的是 模板互补链，而非模板本身。

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作

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(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
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（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
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（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。

筛选含有目的基因的受体细胞的方法

基因工程中重组DNA的两次筛选张辉运江西省遂川中学基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA 片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。

这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。

如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。

【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。

已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。

判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。

【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。

如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。

在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。

第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。

第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。

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■阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称 为阳性克隆子或期望重组子。 ■筛选（选择）：经过各种方法将外源 DNA分子导入受体细胞 后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
■脂质体介导法 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜 状结构，可以将 DNA包在其中，并通过脂质体与原生质体的融 合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。 ■显微注射法 显微注射法是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源 DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主 要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞 的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。 ■花粉管通道法 此法是将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或 传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合 子及早期的胚胎细胞。
■电穿孔法 同原核细胞的电穿孔法。 ■激光微束穿孔转化法 利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性 微孔，处于细胞周围的DNA分子随之进入细胞。 ■超声波介导转化 超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外 源DNA进入细胞。
■基因枪法 利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在 金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞。
■缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的 RNA 转录后加工、修饰系 统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细 胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得 了表达，也不具有正常的生物学活性。
■常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。
大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠 杆菌工程菌生产的。 枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因
辅助菌（含有结合型辅助质粒）
辅助质粒转移
供体菌（含有目的质粒）
含有目的基因的非结合型重组质粒迁移
受体菌
■转化率的计算及其影响因素 转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。 转化率 = 转化子数 / DNA 分子数 （10-5表示 105个DNA 分子获 得一个转化子） 或 转化子数 / DNA质量（106/µg表示1 µg DNA分子得106个转 化子）
菌体悬浮于含 CaCl2 的 预 冷 缓 冲液中，冰水浴 15min， 4 ℃离 心集菌，弃上清， 沉淀物重悬于 CaCl2 的 预 冷 缓 冲液中，4 ℃下 放置12-14 h
37 ℃震荡培养 30-60 min
铺板培养
筛选转化子
图6.1 感受态细胞的制备及转化
图6.2 电穿孔仪及电击杯
图6.2 λ噬菌体的体外包装
表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力， 易于保存和培养。 蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达 的宿主。
（2）真菌细胞
真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制 以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表 达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。 （3）植物细胞 优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的 植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳 定遗传的转基因植物。
影响转化率的因素 a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞 的亲和性。 b：菌株类型
c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂交 接合法最低。
（2）重组λ嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌
■转染（transfection）及转导（transduction）
转染：将重组λ噬菌体DNA 分子直接导入受体细胞中的过程称 为转染。 转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源 DNA分子 转移到受体细胞内的过程。
活化菌种，扩大培养，使其 处 于 对 数 生 长 后 期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml 新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
2.重组DNA分子转入真核细胞
由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂， 适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。 但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方 法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。
（1）重组DNA分子导入植物细胞 ■农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒 -Ti 质粒的T-DNA 能转移至细胞内部。因此，将外源基因与 Ti 质粒 重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。
第六章 目的基因导入受体细胞及重组子 的筛选
第一节 受体细胞
1.受体细胞的概念
受 体 细 胞 （ receptor cell ） ： 又 称 宿 主 细 胞 或 寄 主 细 胞 （host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定 维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的 细胞。 随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细 胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工 程的受体细胞。
2.受体细胞选择所应遵循的原则
便于重组DNA分子导入。 能使重组 DNA 分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶 缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。） 便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的 受体细胞基因型）
遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。
安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于 外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效 分泌表达。
采用λ噬菌体 DNA 直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对 重组的λ噬菌体 DNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染 大肠杆菌。 ■体外包装
体外包装：在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的 一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体 DNA分子包装成 成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。 原理：根据λ噬菌体DNA分子体内包装的途径，分别获得缺失D 包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失 E包装蛋白的λ噬菌体突变 株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的 包装λ噬菌体 DNA。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从 中提取缺失 D蛋白的包装物（含E蛋白）和缺失 E蛋白的包装物 （含D蛋白），两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。
3.重组DNA分子导入哺乳动物细胞
哺乳动物的细胞很难捕获外源 DNA ，这明显影响了哺乳动物 基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外 源DNA导入哺乳动物细胞的方法。 ■病毒颗粒转导法
■磷酸钙转染法
哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物， 使DNA转入细胞。
■DEAE-葡聚糖转染法
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。
具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞
■优点
大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，பைடு நூலகம்含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
Fig. 4-16 TDNA can integrated into the genome of plant cell
■多聚物介导法
一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二 价阳离子（ Ca2+ 、 Mg2+ 、 Mn2+等）于 DNA 混合，能在原生质体 表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入 细胞内。
缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。 方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。 （b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。 （4）动物细胞
■优点：
动物细胞具有 RNA 的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译 后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。 易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。 可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。 ■缺点： 不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细 胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。
二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现短时间的有效表达。
■聚阳离子-DMSO转染法 此方法采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细 胞表面对DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暂处理细胞， 增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。 ■显微注射转基因技术 ■电穿孔DNA转移技术 ■脂质体介导法
第二节 重组DNA分子导入受体细胞
1.重组DNA分子导入原核细胞
（1）重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 ■转化（transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结 合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之 为转化。 ■转化的方法
制备感受态细胞法
感受态细胞：处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态的细 胞。
第三节 重组子的筛选
在重组DNA 分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的 DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。