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第二节重组体导入受体细胞的原理与技术-Xidian

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重组导入受体细胞

重组导入受体细胞

电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数 的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到109～1010转化
子。
电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞 存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导 致50%～70%细菌死亡时，转化效率达到最高。
可以转化大分子DNA（>50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后
缺点： 转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛
选作用（例如卡那霉素在DM3培养基中无效）
不适用于革兰氏阴性菌
III. 电转化
原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低(<106
个/微克DNA)
第十五页，共25页。
2. 酵母菌的转化方法
（1）原生质体转化法 ★
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质 球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质 球总数的1%-5%。但是操作周期长（再生需4~6天），而且转
第四页，共25页。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到106～ 108转化子/gDNA。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以 在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物种需 要不同的诱导方法。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可 以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
一般电穿孔转化须在低温下（0～4℃）进行，转化效率要比在室 温下操作提高约100倍。
由于细菌细胞相对较小，因此与 DNA导入真核细胞时相比，大肠杆 菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以20～ 40μl为宜。

第六章 重组DNA导入受体细胞

第六章 重组DNA导入受体细胞

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

重组基因导入受体细胞

重组基因导入受体细胞
– 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA 和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。 – 细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 – 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和 适宜的温度就能满足生长需要。 – 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 – 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品， 在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒 蓝藻，就可达到锦上添花的效果。
⑨
关于细菌的感受态本质与存在
• 局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化， 即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过 质膜进入细胞。
• 酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶 切位点，使DNA分子能进入细胞。 通常制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用 一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。 CaCl2处理后的细菌一般4℃可保存48h,用于转化，大多数 能在1-2天内具有吸收外源DNA的能力。
(二)枯草杆菌受体细胞
• • 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 1. 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表 达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表 达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下， 真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有 天然的构象和生物活性。 2. 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。 3. 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 4. 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、 分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。

重组基因导入受体细胞优秀课件

重组基因导入受体细胞优秀课件
重组基因导入受体细胞优秀课件
体外标记
• 包括化学法和酶法两种。 • 化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种
基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探 针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制 备非放射性标记物的探针。 • 常用的化学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和 交叉相连法等。 • 酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促 聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸 探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部 分非放射性标记探针。 • 常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记 法、DNA末端标记法及PCR标记法等。
重组基因导入受体细胞优秀课件
• 它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝 胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
重组基因导入受体细胞优秀课件
• 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在 固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交， 在与探针有同源序列的固相DNA的位置上 显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判 断被检测的DNA样品中是否有与探针同源 的片段以及该片段的长度。
• Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从 电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法．又称 为Northern RNA印迹杂交等。
• 该法是在Southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对 RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但 RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处 理。
• 随机引物：46 • 使用随机引物标记的探针一般长400-600个
核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。 与切口平移法不同的是，该方法标记的是 模板互补链，而非模板本身。

重组DNA导入受体细胞

重组DNA导入受体细胞
HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成 含磷酸钙和DNA的沉淀。 细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA 的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞。
对数生长期的细菌和重组λ噬菌体磷酸钙-DNA沉淀混合，先置0℃冰浴 30～60分钟，再放45℃中水浴5分钟，使细菌迅速发生热休克，以利外源 DNA的进入。随后涂布琼脂平皿，培养后观察并选取含有重组DNA的细菌。
感受态细胞（competence cell）是指处于能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态的细胞。
I. 化学诱导感受态法
原理：E.coli 细胞处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中 的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞 表面，经42℃短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而 使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物进入细胞，在丰 富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖， 被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性 培养基平板上，可选出所需的转化子。
感受态细胞制备
培养大肠 杆菌
OD600至0.30.4
On ice 5-10 min
4℃离心收集菌
On ice 30 min
4℃离心收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收集 菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
分装、-70 ℃冻存
制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到 106～108转化子/gDNA。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌 可以在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物 种需要不同的诱导方法。

[生物学]重组基因导入受体细胞

[生物学]重组基因导入受体细胞
of vectors.
大肠杆菌---革兰氏阴性细菌，拟核，4.6*106bp， 转录和翻译偶联，不能进行转录后加工。 Escherichia coli-----Gram-negative bacterium----nucleoid-----4.6*106 base pairs— transcription and translation are coupled----no post-transcriptional modification
理想的受体细胞应该容易操作、繁殖、具有很多已 经定性的菌株、能够接受多种载体。
An ideal host cell should be easy to handle and propagate, should be available as a wide variety of
genetically defined strains, and should accept a range
same material as the haystack.
从稻草中寻找针，大海捞针。
从一个重组子群体中分离一个基因必须考虑以下三个方面： A, the individual recombinant molecules have to be physically separated from each other.---连接至载体。 B, the recombinant molecules have to be amplified to provide enough material for further analysis.---转化至宿主细胞扩 增。 C, the specific fragment of interest has to be selected by some sort of sequence-dependent method. 通过探针鉴别目的克隆 。

基因工程-第五章 重组基因导入受体细胞

基因工程-第五章 重组基因导入受体细胞

1.2蛋白质双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis）： 1.2.1蛋白质分离技术包括：等电聚焦（ Isoelectric Focusing，IEF）和SDS－聚丙烯 酰胺凝胶（SDS-PAGE）两部分。 1.2.2原理：根据蛋白质的等电点和相对分子 质量的差异，利用电泳技术有效分离大量混 合蛋白质组分的技术手段。
2.2大肠杆菌主要分两类：
①用于质粒DNA的复制扩增，如DH5α ； ②用于外源基因的表达，如BL21（DE ）；
三、真核受体细胞（Eukaryotic

Receptor Cells）： 3.1酵母菌（Yeast）: 单细胞真核微生物，其优势： ①结构简单，基因表达调控机制了解得 比较清楚，遗传操作简单； ②具有真核生物蛋白质翻译后修饰加工 系统； ③安全性好；④培养简单；⑤能将外源 基因分泌到培养基中，便于分离纯化。
对有差异的蛋白点进行质谱（Mass Spectrometry）分析
生物高分子质谱仪（Mass Spectrometry）
质谱仪（Mass Spectrometry）的工作原理
一、受体细胞应具备的条件和原则：
1.便于重组DNA分子的导入； 2.能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 3.便于重组体的筛选； 4.遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长； 5.安全性高，无致病性，无环境污染； 6.能使外源基因蛋白表达产物在细胞内积累或 高效分泌表达； 7.在遗传密码的应用上无偏倚性； 8.有较好的翻译后加工机制。
Chapter 5 Introductions of Recombinant Gene into Receptor Cells
第一节 受体细胞（Receptor Cells）

基因工程原理重组基因导入受体细胞

基因工程原理重组基因导入受体细胞
电场强度 参数： 电脉冲时间
外源DNA浓度
当50%～70%菌体细胞死亡时，转化率最高
（五）三亲本杂交（triparental mating）
三亲本杂交结合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用而建 立的一种DNA转化方法。
二、重组基因导入植物受体细胞
（一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。
转化率＝ 转化子
＝
DNA分子数
转化子 细胞数
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离
② 与DNA结合，抗DNase
1. 放射性探针：32P、3H、35S、14C、125I
2. 非放射性探针
（1） 生物素（biotin）标记探针：生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连，在 聚合酶作用参入DNA
连接臂
dUTP
Biotin (维生素H， VH)
（藻红素 ） （链霉亲和素 ） （生物素 ）
（2） 地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连
乳糖操纵子：
。
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
α-互补：是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵 基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
IPTG
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳
（四） 营养缺陷型检测法

重组基因导入受体细胞

重组基因导入受体细胞
4
原核受体细胞
• 枯草芽孢杆菌
• 能将基因表达产物分泌到培养基中 • 一般可表达真核蛋白 • 无致病性 • 可以形成芽孢，方便培养和保存
5
原核受体细胞
• 蓝细菌
• 含叶绿素，能进行光合作用，营养要求低。 • 基因组简单，遗传背景清楚。 • 可以成为植物基因表达的宿主。
6
真核受体细胞
• 酵母菌
• 结构最为简单的真核生物，背景清楚 • 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 • 使用历史悠久，不产生毒素，安全有保障 • 培养简单 • 能将外源基因表达产物分泌到培养基中
– 乙酸锂可使酵母细胞产生短暂的感受性状态。
– PEG可以在高浓度乙酸锂环境中保护细胞膜， 减少乙酸锂对细胞膜的过度损伤，同时促进质 粒与细胞膜的结合。
23
重组DNA分子导入酵母细胞
• 用溶菌酶剥去酵母菌的细胞壁，形成原生 质体。
– 酵母细胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖两类 多糖组成，含有少量的蛋白质、脂肪、矿物质
重组基因导入到受体细胞
1
受体细胞
• 能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 • 受体细胞应具有的特性：
• 1. 便于导入 • 2. 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中 • 3. 便于筛选 • 4. 密码子使用没有明显的偏倚 • 5. 安全性高
➢并不是所有的细胞都可以用来做受体细胞
2
原核受体细胞
• 1. 没有核膜 • 2. 基因组简单
• 基于非结合型质粒的迁移作用而建立的一 种转化方式。
– 接合型质粒、非接合性质粒 – 将接合质粒转移到含有重组质粒的供体细胞中，
然后将供体细胞与受体细胞混合，促使转化。 – 三亲本：受体菌、含重组质粒的供体菌、含有

第二节重组体导入受体细胞的原理与技术-Xidian

第二节重组体导入受体细胞的原理与技术-Xidian
指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子 的过程。 转导和转染的区别
转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程。
转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。
（一）转化 （transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation）
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化
酶去壁
CaCl2
酵母
原生质体 PEG 感受态
转 插入外源基因的载体 化
转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受 再生率影响
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl 处理 感受态
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收集 菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
分装、 -70 ℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
重组体导入受体细胞
简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。
10ng载体DNA 100L感受态菌
吸附DNA
On ice混合，静 置30分钟
摄入DNA 42ºC 1.5分钟
生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内
原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各
种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.
转化效率高（高于109/gDNA）
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
LB培养受体菌 至OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2℃离心集菌
冰冷的水重悬菌体

外源基因导入受体细胞的方法及原理

外源基因导入受体细胞的方法及原理

外源基因导入受体细胞的方法及原理哎呀，你问的问题可真不简单啊！让我想想怎么跟你解释外源基因导入受体细胞的方法及原理吧。

不过，在这之前，我得先跟你说说基因是什么东东。

基因，其实就是我们身体里的小秘密。

它们就像是一本本神秘的日记，记录着我们的身高、体重、眼睛颜色等等。

而外源基因呢，就是从外面“借”来的基因。

比如说，你想让你的头发变得绿油油的，那你就可以让科学家把你头发变绿的基因“借”到你自己的身体里，然后你的头发就会变成绿色啦！那么，外源基因怎么才能进入我们的身体呢？这就涉及到一个叫做“基因转移”的过程了。

简单来说，这个过程就是把外源基因放到一个特殊的“快递袋”里，然后再把它送到我们的细胞门口。

这个“快递袋”叫做病毒载体，它可以保护外源基因不被破坏，还能让它顺利地进入我们的细胞。

现在你知道外源基因导入受体细胞的方法了吗？接下来，我就给你讲讲这个过程的原理吧。

其实，这个过程就像是一场精心策划的约会。

科学家会找到一个跟我们身体相似的“搭档”，也就是受体细胞。

然后，他们会在这个搭档身上安装一个“快递袋”，并且把外源基因放进去。

他们会把这个搭档送到我们的身边，让我们的身体接受这个来自外部的礼物。

好了，我知道你已经有点晕了。

让我再换个方式告诉你吧。

其实，外源基因导入受体细胞的过程就像是我们在超市里购物一样。

我们要买的东西放在货架上，然后我们去付款。

科学家要把外源基因放在病毒载体上，然后送到我们的细胞门口。

我们的身体就像是一个收银台，会检查这个包裹是否合法，然后决定是否接受它。

外源基因导入受体细胞的方法及原理虽然有点复杂，但是它可以帮助我们治疗很多疾病，甚至改变我们的身体特征。

所以，科学真的很神奇啊！希望我能帮到你理解这个问题。

如果你还有其他问题，随时问我哦！。

基因工程5-2 (简要) 基因的分离、重组及重组体向受体细胞的导入

基因工程5-2 (简要) 基因的分离、重组及重组体向受体细胞的导入

为了得到真核基因，一般是先分离纯化目 的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进 行cDNA的克细胞中，mRNA约为总RNA的1~5％， 提取特异mRNA，需要选择特异而高度分化的 组织。例如，胰岛素基因的 mRNA在胰脏组织 中含量丰富，珠蛋白基因的mRNA在血红蛋白 细胞中含量丰富。因此，能否选择到富含某种 特 异 mRNA 的 组 织 细 胞 ， 是 获 得 大 量 纯 化 mRNA的关键。
Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌（一种生活 在温度高达75℃的热泉中的细菌）中分离纯化出 来的，具有耐高温的特性，其最适活性温度是 72℃，连续保温30 min仍具有相当的活性，而且 在比较宽的稳定范围内都保持着催化DNA合成的 能力，一次加酶即可满足PCR全过程的需求。 然而Taq DNA聚合酶失去了3’5’方向的 校正活性，在一次PCR过程中造成的核苷酸错误 参入的机率大约是每 2 10 4 个核苷酸中有一个。 对于大批量的PCR产物分析而言，由于错误的核 苷酸所占的比例极小，不会构成严重问题；如果 PCR扩增的DNA片段是用于分子克隆的，需加以 重视，要检测克隆产物的DNA序列，以便弄清在 PCR过程中可能发生的任何突变。
* 体内转译系统：如非洲爪蛙卵母细胞系统，该 方法转译效率高，十分灵敏；但活细胞成分较 多，较难纯化蛋白产物。
4. 逆转录合成双链cDNA (1) 以 poly(A) RNA 为模板，寡聚 (dT) 作引物， 加入四种三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，在逆转录 酶作用下合成第一条互补 DNA 链，这条链在 末端会弯回形成一个发夹结构； (2) 碱处理降解 DNA 杂交双链中的 RNA 模板链； (3) 以第一条链cDNA链为膜板，发夹结构作引 物，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或其Klenow 片段）作用下，加入四种dNTP，合成第二条 DNA链； (4) 用特异切除单链的S1酶切去发夹环部分，最 终得到平端d末端转移 酶和 dCTP 将 cDNA 补上聚 (C) 的尾巴，然后与 经过限制酶消化并补上聚(G)尾巴的PBR322质 粒连接，形成重组体，再转化到大肠杆菌中进 行扩增。

第二章基因工程重组DNA导入受体细胞

第二章基因工程重组DNA导入受体细胞
菌株则将三个基因同时失活。
转化亲和型
可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通 透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化 效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的 菌株作为受体菌细胞。
遗传互补型
遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细 胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。方能使 转化细胞的筛选成为可能。
遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素乙型 肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。
蓝细菌（蓝藻）
蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素 a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ) 和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又 具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞 器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。
具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高 效表达。
在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
6、受体细胞应具备的条件
野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具
有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性
因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行 遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株
第二章基因工程重组DNA导 入受体细胞
一、重组DNA转化
1、转化概念 转化 ：DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的 受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变 其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的 转化（Transformation）。 重组DNA 人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、
二、受体细胞
受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞 感受态(competence)：是指细菌吸收外源DNA的

受体细胞PPT课件

受体细胞PPT课件
8
酵母菌 a.结构最简单的真核生物， 遗传背景较为清楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养 e.可分泌
9
三.植物细胞
具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁
原生质体转化(纤维素酶处理) 基因枪或农杆菌直接转化
植物细胞的突出优点: 细胞具有全能性
10
四.动物细胞
多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养
50
2.营养缺陷型筛选
转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相 关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型 培养基上生长。 这种培养基对于非转基因克隆是致死的。
51
2.形成噬菌斑
噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型
形成噬菌斑即为重组子，空载不能有效包装
插入型 空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选
①便于重组DNA分子导入 ②便于重组DNA分子稳定存在于细胞中 ③便于重组子的筛选 ④遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵 ⑤安全性高，无致病性 ⑥最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低 ⑦密码子无明显偏爱性 ⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达 ⑨理论与实践上具有较高的应用价值
3
一.原核生物细胞
CI蛋白编码区
Tc r
HindIII Bgl I
CI蛋白结合区
44
(4)显色互补筛选法
α-互补
β-半乳糖苷酶基因(LacZ)
载体(含LacZ’ ) LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息，编码α-互补肽
宿主菌 编码的缺陷型β-半乳糖苷酶 Nhomakorabeaβ肽段45
乳糖类似物诱导 IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)
600bp
55
三. 核酸分子杂交检测法 核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适 宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配 对原则特异性地复性，形成双链。
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（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将重组DNA转入含有Vir致病 基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染植 物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 含 有 外 源 目 的 基 因 的 T-DNA 整合到植物细胞基因组中，获 得转基因植株
生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内
原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各
种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.
转化效率高（高于109/gDNA）
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
LB培养受体菌 至OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2℃离心集菌
冰冷的水重悬菌体
少量冰冷的水 重悬
对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶 液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性， 制备感受态细胞。
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
细菌感受态细胞的制备过程
培养大肠 杆菌
OD600至0.30.4
On ice 5-10 min
4℃离心收集 菌
On ice 30 min
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收集 菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
分装、 -70 ℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
重组体导入受体细胞
简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。
10ng载体DNA 100L感受态菌
吸附DNA
On ice混合，静 置30分钟
摄入DNA 42ºC 1.5分钟
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导） 2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等） 3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体的TDNA区，形成重组DNA
热激
40% 插入外源基因的载体 PEG4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
3. PEG1000转化
PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用 于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA （3）单链转化率高于双链
（3）PEG介导的原生质体转化
（4）接合转化
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
1、化学转化法
感受态：细菌能从周围环境中吸收 DNA的生理状态称为感受态(competence).
感受态的出现是由于细菌表面出现 许多DNA结合位点，这些位点只能与双 链DNA结合，而不与单链DNA结合。 这 说明完整的双链结构对于转化活性来说是 必要的。
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
4. 外植体的培养
3. 电击法（电穿孔法）
纤维素酶 植物细胞 和果胶酶 原生质体
DNA
电击处 理 选择培养
愈伤组织 分化
混合入 电击缓冲
液
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法
指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子 的过程。 转导和转染的区别
转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程。
转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。
（一）转化 （transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation）
热休克法
10-100L转化液涂含抗 菌素的平板
37℃摇1小时
加入1mL LB培 养基
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
平板培养基培养细菌
10-100L转化液
涂于含抗菌素的平板
37℃过夜
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转
化仪的样品池中，两极施加高压电场。 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产
2 ℃离心收 集菌体
冰冷的水重悬 菌体
2 ℃离心集菌
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
On ice混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器200400
电击转化法
转化
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37 ℃中速震荡60 分钟
加入1mLSOC 培养液
（二） 转 导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转 移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。
叶
盘
法
的
在饲养平皿的 滤纸上培养2天
具
体
操
作
2. 基因枪法（gene gun）
又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属 微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。
DNA 1.2m钨弹头 基因枪
吸附
装入
外植体制备
轰击
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细 胞
基因枪
1. DNA微弹的制备
具 体 操 作
每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒， 直接被感受态细胞捕获的过程。
与转化无本质区别
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称 转染
体 外 包 装 过 程
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法 4. 电击法
第二节 重组体导入受体细胞的原理 与技术
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
相关概念
1.转化(transformation)
细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。 2.转导(transduction)
以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 3.转染 (transfection)
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化
酶去壁
CaCl2
酵母
原生质体 PEG 感受态
转 插入外源基因的载体 化

转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受 再生率影响
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl 处理 感受态