癌相关成纤维细胞的分化来源

癌相关成纤维细胞的分化来源 本文原载于《国际肿瘤学杂志》2017年第2期 癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast，CAF)在肿瘤微环境中的重要作用已受到广泛的重视。该细胞通过与癌细胞的直接接触、分泌多种因子以及对肿瘤基质的改造，促进肿瘤的发生、发展、转移甚至耐药性的发生[1]。随着研究的深入，有人提出CAF可能成为抗肿瘤治疗的新靶点[2]。然而CAF的分化来源多样，相应的形态和功能各异，因此深入了解CAF的分化来源有利于更全面地认识肿瘤发展的机制，为临床治疗提供理论依据。

1 CAF形态特征及标志物 CAF是一种处于持续活化状态的成纤维细胞，是肿瘤基质中最重要的细胞成分之一。CAF胞体呈大小不均的纺锤形，胞质突触少，排列无方向性，胞质富含应力纤维。该细胞的特异性标志物包括：α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、腱蛋白C、骨膜蛋白、NG2硫酸软骨素蛋白多糖、血小板源性生长因子受体α/β、成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)。而波形蛋白、纤连蛋白、Ⅰ型胶原、脯氨酸4羟化酶、成纤维细胞表面蛋白、成纤维细胞特异蛋白(fibroblast specific protein，FSP)-1等则被用于对包括CAF在内的间质细胞的鉴定[2]。其中α-SMA、FAP及波形蛋白的使用最为广泛，FAP通过解离与基质蛋白结合的生长因子，发挥促肿瘤微血管生成及促肿瘤细胞生长的作用，对肿瘤的浸润、转移及复发具有重要意义。

2 CAF分化来源 2.1 成纤维细胞 成纤维细胞广泛分布于机体的各个组织和器官。主流观点认为肿瘤基质中正常(静息态)的成纤维细胞，可在癌细胞分泌的生长因子或细胞因子的作用下激活、分化成为CAF，后者转而促进癌细胞的增殖、侵袭和转移。然而研究显示即使脱离了癌细胞，CAF在遗传学或表观遗传学上已经发生改变[3]。 近期有报道，活性氧簇可通过上调乏氧诱导因子1α和趋化因子CXCL12促进成纤维细胞的活化[4]。敲除大鼠乳腺癌中氧化应激负向调节因子JunD基因后，发现肿瘤间质成分发生显著改变，并且JunD－/

－成纤维细胞高表达波形蛋白，CAF数量显著增加。基因分析发现该变化与编码细胞外基质和基质金属蛋白酶相关基因表达上调有关，该研究表明氧化应激可促进成纤维细胞的活化，影响肿瘤的发展。 Mitra等[5]研究证实，微小RNA(miRNA)可协助癌细胞诱导正常成纤维细胞转分化为CAF。miRNA是一种内源性、具有转录后基因调控功能的非编码RNA，成熟的miRNA组装进RNA诱导的沉默复合体，降解靶RNA或阻遏其翻译，其异常表达与多种肿瘤发生、发展密切相关，具有癌基因或抑癌基因作用。在卵巢癌中可观察到miR-31、miR-214明显下调和miR-155上调，这3种miRNA的联合表达可促进成纤维细胞的活化，增强其迁移、侵袭及增殖的能力。利用miRNA及其抑制剂干预后，可证实成纤维细胞向CAF的功能转化，所获得的CAF与原代CAF在驱化因子相关基因的表达上具有高度相似性，其中以miR-214的靶分子CCL5最为显著。随后，Pang等[6]将胰腺成纤维细胞及胰腺癌细胞共培养，发现正常成纤维细胞向CAF的转化，深入研究发现，无论是运用含有高水平miR-155胰腺癌来源的微囊泡(外泌体)处理正常细胞，还是通过下调miR-155相关蛋白，均可得到类似结果。从而证实miR-155是改变成纤维细胞表型、使之向CAF转化的关键因素。 以上研究不仅证实成纤维细胞是CAF的重要来源，还发现通过miRNA干预，可促进CAF表型转换与表观遗传学的改变，促进肿瘤的发生、侵袭和转移。因此，无论是针对CAF还是针对参与其分化过程的微囊泡、miRNA等物质都可成为抗肿瘤研究的突破点。 2.2 上皮-间质转化 上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、器官纤维化和癌细胞转移中扮演重要角色。上皮细胞黏附分子如E-钙黏蛋白(E-cadherin)等的减少或丢失是EMT的标志性变化，进而呈现许多非上皮细胞的特征：细胞骨架以波形蛋白为主，上皮表型消失，间质表型出现，细胞失去极性而脱离基底膜，胞间黏附力降低，获得较强的迁移、侵袭、抗凋亡能力[7]。 Dehai等[8]在体外培养肺癌细胞(A549)中发现，在给予外源性白细胞介素(IL)-6培养24 h后，原呈现紧密排列的细胞呈梭形改变，细胞间隙由紧密变为疏松。同时发现上皮细胞的标志物E-cadherin表达显著降低，而间质细胞标志物波形蛋白表达上调；同时细胞的侵袭能力较对照组显著提高。 转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β可通过激活经典Smad通路或非Smad通路(包括Ras-ERK通路、JNK通路、p38MAPK通路等)诱导上皮细胞发生EMT。Watanabe-Takano等[9]用TGF-β1处理Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)后发现，TGF-β1通过激活该细胞的Ras-ERK信号而发生EMT，转化为活化的成纤维细胞。Ras-ERK通路是MAPK众多通路中的一条，该通路可负向调节TGF-β1功能而参与RLE-6TN细胞EMT的调控，而该通路抑制剂DA-Raf在TGF-β1诱导的EMT中被证实具有重要作用。 2.3 内皮-间质转化 内皮-间质转化(endothelial to mesenchymal transition，EndMT)是指组织中的内皮细胞在某些刺激下获得间质细胞样表型。在转化过程中，内皮细胞首先发生细胞-细胞脱离，从原细胞层脱落，形态上呈长梭形，失去内皮细胞特征(如CD31和E-cadherin分子等)，而表达间质细胞标志物(如α-SMA和FSP-1等)。EndMT参与多种疾病的发生，如心、肾等器官纤维化、动脉粥样硬化、伤口愈合等，同时也是CAF的重要来源[10]。 有研究通过两种动物模型发现，癌组织中有较大部分的CAF具有内皮源性，其中约11%的α-SMA＋细胞同时高表达CD31，而约40%的FSP-1＋血管周围细胞也表达CD31[11]。随后运用内皮细胞不可逆表达lacZ蛋白的转基因动物进行了验证，并得到了类似的结果。Nie等[12]体外共培养食管微血管内皮细胞与食管腺癌细胞3 d后，内皮细胞由鹅卵石样向长梭形样结构转变，无论是PCR还是免疫荧光染色均观察到波形蛋白、FSP等间质细胞标志物高表达，而CD31或E-cadherin的表达下降。 2.4 骨髓干细胞 骨髓干细胞包括骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)与骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)，MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢能力。在炎症或组织损伤时，迁移至损伤处的MSC通过分泌表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等参与修复；当迁移至肿瘤组织时，通过基质形成、分泌生长因子、促侵袭相关蛋白和促血管生成因子改造肿瘤微环境[13]。 Paggetti等[14]使用慢性淋巴细胞性白血病来源的微囊泡(外泌体)处理骨髓MSC后，发现骨髓MSC的细胞骨架发生改变，大量应力纤维形成。进一步分析发现不仅α-SMA、细胞因子、驱化因子及促血管生成因子大量表达，还检测到多种CAF特征性基因的表达，证明MSC可向CAF表型转化。同样，将人MSC暴露于肿瘤条件培养基中，可观察到CAF样表型的细胞出现，并展现出类似的功能特性，如持续表达基质细胞衍生因子-1，促进癌细胞生长，表达α-SMA和FSP等标志物，分析基因表达谱发现培养得到的细胞与CAF也具有相似性[15]。 作为骨髓干细胞的另一个重要成员，骨髓HSC除了造血功能外，还可分化为其他若干组织细胞类型，如肥大细胞和破骨细胞。近期研究发现，HSC也具有促肿瘤作用[16]。Mcdonald等[17]将表达绿色荧光蛋白的Lin－Sca1＋c-kithiCD34－HSC与癌细胞先后注射入小鼠中，肿瘤组织中可发现表达绿色荧光蛋白的成纤维细胞样表型的细胞，并表达活化成纤维细胞的标志物(Ⅰ型胶原和α-SMA)，同时通过参与细胞外基质的重构促进肿瘤进展与血管形成。 以上实验证实无论是骨髓MSC还是骨髓HSC，在肿瘤微环境中，通过分泌多种细胞因子、信号分子等相互作用，发生级联反应，最终导致其形态、结构、生长、分化、代谢等生物学特性的改变，进而促进肿瘤进展。 2.5 脂肪干细胞 脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cell，ASC)是从脂肪组织中分离获得的具有多分化潜能的干细胞，主要参与组织细胞的功能修复和再生。在肿瘤中，ASC分布于癌组织周围，与癌细胞直接接触，通过细胞间相互作用，发挥其促肿瘤生长作用。 Kidd等[18]在乳腺模型中，发现在小鼠体内移植高表达绿色荧光蛋白的脂肪组织后，在其周围注入乳腺癌细胞，观察到约55%的绿色荧光细胞表现α-SMA＋，相当一部分FSP＋、FAP＋的CAF源于MSC或ASC，其中尤以周细胞、α-SMA＋活化成纤维细胞及内皮细胞更为显著。Jotzu等[19]用乳腺癌细胞的条件培养基处理人源ASC后，观察到部分ASC向CAF样表型转化。此外，ASC的侵袭性增强，波形蛋白、α-SMA、CXCL12及CCL5等蛋白表达增加。深入研究发现，该现象与条件培养基中富含的TGF-β1有关。 前文已述，外泌体可促进成纤维细胞分化为CAF。Cho等[20]研究表明，在乳腺癌中，外泌体同样可促使ASC转化为活化的成纤维细胞(高表达α-SMA)，干预后的ASC被诱导产生促肿瘤生长因子CXCL12、血管内皮生长因子、CCL5、TGF-β1及其受体。该小组进一步研究证实，外泌体通过激活Smad通路促使ASC向活化成纤维细胞转化。

3 潜在CAF干预靶点 鉴于其在肿瘤发生发展中的重要作用，如何针对CAF开发治疗方法一直是抗癌研究的热点。运用针对FAP的DNA疫苗消除CAF后，肿瘤微环境中的免疫类型由Th2型转变为Th1型[21]。相应的，对树突状细胞及CD8＋T细胞的趋化增强，IL-4、IL-6表达降低，而IL-2、IL-7表达增加，肿瘤新生血管及淋巴管的生成受到抑制，增强了化疗药物(多柔比星)的疗效。 Li等[22]的研究则发现，使用奥沙利铂会促进CAF生成因子的表达，从而增加肿瘤微环境中CAF的数量；而将奥沙利铂与小分子二肽基肽酶抑制剂PT-100(可靶向结合FAP、抑制CAF的产生)共同作用于荷瘤小鼠模型时，肿瘤中CAF数量明显减少，动物生存期显著延长。该研究证实，CAF抑制剂联合化疗药物可增加化疗药物疗效，减少促肿瘤