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结肠炎动物模型具体步骤及方法预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制结肠炎动物模型具体步骤及方法原型物种人来源三硝基苯磺酸钠(TNBS)导致的结肠炎模式动物品系SPF级SD大鼠，健康，6~8W，雄性，体重为180g-200g。
实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。
实验周期4-6 weeks建模方法模型制作方法：动物造模当日计为实验第1天，各组动物造模前禁食不禁水24 h，乙醚吸入麻醉，将一直径2.0 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm，缓慢注入一定浓度的TNBS的乙醇溶液，1 min之内完成。
灌药完毕后，缓慢拔出塑胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，持续倒置3min，避免造模试剂流出，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。
对照组动物使用等体积的生理盐水，按上述同样操作进行灌肠。
各组动物均正常饲养。
TNBS的乙醇溶液（将体积分数为5%的TNBS水溶液与无水乙醇以体积2:1混合）现配现用。
应用用于结肠炎药物的研发和机理的研究1. 一般情况观察及体重记录一般观察：观察各组动物的情况，若出现意外症状，记录情况并及时反馈；记录可能出现的死亡率。
体重：从给药前一天开始，每三天称量并记录各组动物体重，直至给药结束，绘制体重变化曲线。
实验过程中体重共记录10次体重统计、变化曲线作图。
2. 肠组织取材及大体评分：各组动物安乐死后，解剖时截取自肛门向上的整段结肠组织测量结肠长度进行宏观评价：各个结肠组织带标尺拍照，记录原始的大体形态，依照评分标准进行评分。
结肠组织大体评分标准如下：0分无损伤1分充血但没有溃疡2分充血而且肠壁变厚但没有溃疡3分有一处小溃疡，最长径约0-1cm4分溃疡较大，最长径约1-2cm5分溃疡较大，最长径>2cm对应以上评分标准，记录每份结肠组织的具体评分。
评分标准参考文献：Wallace JL, Keenan CM. An orally active inhibitro of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis. Am J Physiol,1990 258:G527-G5343.3 结肠组织病理染色：组织做以下处理：每个结肠均分成3段，每个动物取材的位置要尽量一致（不管剪切位置是否有病理损伤尽量保持一致）。
小鼠乙酸诱导肠炎模型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症，其原因不明，是非特异性肠道炎症，其病变部位好发于直肠和结肠，多表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便、里急后重，具有易反复、病程迁延、不易治愈的特点。
可能与细菌感染、食物或异物损伤、长期饲喂精饲料、滥用抗生素类药物及精神障碍等有一定的关系。
在我国，UC的发病率有逐年增高的趋势，逐渐引起了人们的重视。
到目前为止溃疡性结肠炎的病因及发病机制尚未完全明确，研究表明肠黏膜出现慢性炎症可能与基因、环境、微生物及免疫功能的失调等多种因素相互作用有关。
1.实验动物SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。
2.实验分组：实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
3.实验周期7d4.建模方法1. 小鼠术前12 h禁食，自由饮水。
2. 3%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉(40mg／kg)小鼠，小鼠取头低尾高体位，将聚乙烯导管经肛门缓慢插入结肠3cm并经其注入5％乙酸0．4 mL，捏紧小鼠肛门倒提30 s后，注入生理盐水lmL冲洗，正常组注入等量生理盐水对照，造模结束后让小鼠平躺，自然清醒，常规饲养。
3. 7d后摘眼球取血，静止30min，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。
处死小鼠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，预冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，肉眼观察各组小鼠结肠的大体改变，测量结肠长度及记录湿重。
剪取病变最严重的结肠1 cm，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(厚4um)，HE染色。
观察病理改变，其余结肠置于～80℃冰箱备用。
5.模型评价1. 疾病活动指数(DAI)评分：造模后观察小鼠每日腹泻、血便及体重变化情况，并记录小鼠的一般情况。
造模后，模型组小鼠体重明显下降，出现身体蜷缩，毛发竖立，行动迟缓，食欲减退，大便稀溏的症状。
溃疡性结肠炎相关实验研究进展述评(一)【关键词】溃疡性结肠炎相关实验研究进展述评慢性溃疡性结肠炎（UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重等为主要症状，以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的一种消化道疾病。
随着人们生活水平的不断提高和饮食结构、习惯的改变，其发病率呈现逐年上升趋势。
本病治愈难度大，且愈后易再发，与结肠癌的发病存在一定关系，被世界卫生组织列为现代难治病之一。
近年对于本病的中西医实验研究取得了较大的进展。
现针对国内近7年的实验研究大体进展综述如下。
1动物模型的建立理想的慢性溃疡性结肠炎实验动物模型应具备如下特点：（1）肠道炎症的发生，以及病程、病理生理学改变与UC相同或相似；（2）实验动物应具有明确的遗传背景；（3）以已知抗原能诱导免疫反应；（4）用传统UC治疗药物治疗有效；（5）实验动物在没有遗传或化学药物干预情况下，能自发形成肠道炎症。
实际上很少有如此理想的动物模型，目前所制作和使用的肠道炎症实验动物模型一般所选用的动物为大鼠（SD或Wistar大白鼠）、小鼠、豚鼠；实验模型分为4类，即化学药物诱导型动物模型3类和依据中医证型特点开发的实验研究模型1类。
化学药物诱导型动物模型3类。
（1）葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium，DSS)〔1〕：DSS是一种由蔗糖合成的硫酸多醣体，具有与肝素相同的抗止血和抗凝血作用，其诱发的病理改变更接近人类UC特点，通过不同时间段给予BALB/c小鼠5%DSS溶液和蒸馏水，造建急性、慢性、急慢性交替期UC模型，已取得较理想的病理结果。
（2）过氧化亚硝酸钠法〔2〕：过氧化亚硝酸钠诱导大鼠溃疡性结肠炎建立WistarUC实验模型，结果显示，应用过氧化亚硝酸钠造模具有制作简便、重复性好、制作成本低廉的优点，其形态学改变能反映UC发病的部分本质机制。
（3）三硝基苯磺酸（TNBS）／乙醇模型〔3〕：TNBS与大分子组织蛋白合成一种抗原物质致T细胞致敏，溶解与半抗原结合的自身细胞，导致炎症的发生。
消化系统疾病动物模型（一）胃肠疾病动物模型1、急性胃炎动物模型（1）酸制剂诱发急性胃炎模型：Wistar大鼠，雄性，300g，大鼠禁食24h，在清醒状态下，用下述试剂或物质灌胃：①水杨酸制剂（如20mmol／L阿司匹林或水杨酸溶液）按100mg／kg体重灌胃；②2ml10mmol／L的醋酸或2ml不同浓度的盐酸（1、10、100mmol／L）；③2ml同种动物胆汁或2mmol／L的牛磺胆酸；④2ml15％的乙醇。
4h 后处死动物，剖检可见胃内发生急性弥漫性炎症改变。
胃粘膜表面有浅表糜烂、出血，粘膜层内见中性粒细胞浸润。
（2）胆汁反流性胃炎模型：碱性肠液倒流入胃，刺激胃粘膜可引起炎症，即胆汁反流性胃炎。
常见于原发性或继发性幽门功能紊乱或胃切除手术后。
本法取上部小肠的碱性肠液注入已结扎幽门的同种大鼠胃内，使之对胃粘膜产生持续刺激，形成胃炎。
动物选取雄性Wistar大鼠，体重180～220g,制备上部小肠液，向胃内注入小肠液，2 ml/只（正常对照组注入2 ml生理盐水）。
缝合腹壁，腹腔注射阿托品5 mg/kg体重，以抑制胃液分泌，利于胃粘膜损伤模型的形成。
处死大鼠，开腹，结扎贲门，取出胃，沿胃大弯剪开。
用滤纸吸干表面水分，立即称量胃重，以胃湿重/体重之比（胃系数）表示胃水肿程度。
肉眼观察并计数整个胃粘膜出血点数，作为损伤指数。
模型组动物胃系数和损伤指数明显增加，肉眼观察模型组胃粘膜充血、水肿，皱襞减少，颜色暗红，并有大量散在出血点。
2、慢性胃炎动物模型（1）大鼠慢性萎缩性胃炎模型酗酒、用药不当、饮食习惯不良、幽门螺杆菌感染、自身免疫等是此病的主要病因。
组织病理学是评价造模成功的最主要指标，主要观察和测量胃粘膜厚度、粘膜肌层厚度、腺体数量、壁细胞数量、固有层炎细胞浸润程度和肠化生发生率等。
综合法一：胆汁（去氧胆酸钠）+热水+主动免疫综合法二：去氧胆酸钠+热糊+主动免疫综合法三：去氧胆酸钠+酒精+氨水+吲哚美锌3、动物胃粘膜肠上皮化生模型（1）X线胃局部照射诱发胃粘膜肠化生模型：选用5～8周龄的Wistar 或JCL/SD大鼠。
实验性溃疡性结肠炎动物模型的造模选择摘要溃疡性结肠炎（CU）在欧美国家相当常见。
国内虽未见明确的流行病学报道，但近年发病率似有上升趋势。
虽有感染、遗传、精神因素、过敏、免疫等多种发病学说，但其病因、发病机制、药物治疗机制，尚未完全清楚［1］。
中医中药在辨证分型基础上组方，口服及局部治疗CU 有较好的疗效［2］。
选择合适的动物疾病模型，探索中医中药治疗机制对深入研究CU具有重要意义。
关键词结肠炎；溃疡性；疾病模型、动物；动物、实验1动物及类型1.1动物选择自发性溃疡性结肠炎在马、猴、猪等动物中都有散发，因病因不明，病情轻重不一，难以作为动物模型为实验所用［3］，目前国内外常用大白鼠、豚鼠、家兔为实验动物，药物学方法最常选用白鼠。
1.2模型类型①西医病理模型：以CU患者临床症状及病理特征为参照，运用药物、免疫等方法作用于动物，造成与人类疾病相近似的动物模型；②中医“证”与西医“病”相结合的模型：运用综合方法复制既符合中医证型又符合西医病症的CU模型。
如湿热型溃疡性结肠炎模型［4］2造模方法常用方法大致可以分为3类：药物学方法、免疫学方法和复合法。
2.1药物学方法2.1.1乙酸刺激法［4-7］乙酸是一种有机酸，呈弱酸性，具有使血管通透性增加，激活激肽，促进纤维蛋白水解及干扰凝血过程等作用，对动物胃肠粘膜有刺激作用，可以引起粘膜损伤。
1970年开始用于制作CU的鼠模型，至今仍广泛使用。
方法：SD大白鼠，体质量200g～250g，雌雄兼用，造模前禁食17h～24h，经肛门注入5g·L-1肥皂水1.5mL，约30min后用20g·L-1戊巴比妥钠经腹腔麻醉，插入直径３mm的聚乙烯纤维导管至大鼠直肠内，深度约5cm～7cm，注入50mL·L-1或100mL·L-1乙酸溶液1.5mL，准确计时10s～20s后再注入生理盐水3mL～5mL冲洗，以消除乙酸的作用。
之后，常规饲养。
溃疡性结肠炎动物模型构建方法的研究进展田家华1，索小涛1，马晨曦1，郑丽红2，王海强11 黑龙江中医药大学附属第一医院消化二科，哈尔滨150040；2 黑龙江中医药大学附属第四医院消化内科摘要：溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其确切发病机制尚不完全清楚。
目前，UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。
但UC病程往往较长，病情迁延难愈，缓解期与活动期交替出现，病例收集和随访难度较大。
而UC动物模型可模拟UC肠黏膜屏障损伤、肠道炎症状态及菌群紊乱情况。
因此，通过构建合理的动物模型对揭示UC的发病机制、探索高效的治疗策略至关重要。
目前，UC动物模型的构建方法主要有诱导法、基因敲除法和联合法。
根据诱导剂不同，诱导法可分为化学药物诱导法、微生物诱导法和食物诱导法。
根据敲除基因不同，基因敲除法可分为屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。
而联合法一般采取两种及以上方法构建UC动物模型。
这些模型构建方法各有利弊，应根据自身实验需求和实验条件选择最适合的动物模型。
关键词：溃疡性结肠炎；动物模型；诱导法；基因敲除法；联合法doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2024.13.027中图分类号：R574.6；R-332 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2024）13-0111-04溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，病理改变主要累及结肠或直肠的黏膜层和黏膜下层，临床表现为黏液脓血便、间断性腹泻、腹痛、里急后重等。
有研究表明，UC可增加自身免疫性肝病、结直肠癌、贫血等疾病的发生风险，并可引起焦虑、抑郁等精神心理疾病，给患者造成沉重的经济负担和巨大的心理压力［1-3］。
目前，UC的确切发病机制尚不完全清楚，可能与肠道微生态失衡、自身免疫功能紊乱以及家族遗传等因素有关［4］。
UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。
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-α的mRNA 水平和血清中的蛋白水平显著上调,MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理均能抑制IL -1β和TNF -α的表达水平㊂结论:在TNBS /㊃945㊃ʌ基金项目ɔ河北省中医药管理局科研计划项目,(编号:2024178)ʌ通讯作者ɔ王㊀婧乙醇诱导的UC小鼠模型中,MSLZ可以抑制结肠组织中和血清中Let-7i-5p的表达㊂此外,MSLZ还通过抑制UC小鼠的TLR4/MyD88依赖性通路来抑制炎症因子的释放㊂ʌ关键词ɔ㊀溃疡性结肠炎;㊀美沙拉嗪;㊀Let-7i-5p;㊀TLR4/MyD88依赖性通路ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoiɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2024.04.04Regulatory Mechanism of Mesalazine on Let-7i-5p/TLR4/MyD88Signaling Pathway in a Mouse Model of Ulcerative ColitisMAO Zhenzhen,LIU Jing,ZHANG Chenhua,et al(Cangzhou Central Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine/CangzhouSecond People's Hospital,Hebei Cangzhou061000,China)ʌAbstractɔObjective:To investigate the regulatory mechanism of mesalazine(MSLZ)on Let-7i-5p and TLR4/MyD88signaling pathway in a mouse model of2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)-in-duced ulcerative colitis(UC).Methods:A UC model was established using the TNBS/ethanol method.Forty -four male mice were randomly divided into four groups:control group,model group,MSLZ group,and Let-7i-5p inhibitor group,with11mice in each group.Mice were gavaged or intraperitoneally injected with corre-sponding drugs or saline for14consecutive days.The expression levels of Let-7i-5p in colon tissues and ser-um of mice were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR).The pathological changes of colon tissues were observed by hematoxylin and eosin(HE)staining under a microscope.The mR-NA and protein levels of TLR4/MyD88signaling pathway-related genes in colon tissues of mice were detected by qRT-PCR,Western blot,and immunohistochemistry,respectively.The expression levels of TNF-αand IL-1βin mouse serum were detected by ELISA.Results:According to the disease activity index(DAI),co-lon damage score,and pathological lesion score,the mouse UC model was successfully established.The ex-pression levels of Let-7i-5p in colon tissues and serum of mice in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.0001).Compared with the model group,both MSLZ and Let-7i-5p in-hibitor treatment could significantly inhibit the expression of Let-7i-5p(P<0.0001).Compared with the control group,the mRNA and protein levels of TLR4/MyD88signaling pathway-related genes(including TLR4,MyD88,TRAF-6,and NF-κB)in colon tissues of mice in the model group were significantly upregu-lated.MSLZ and Let-7i-5p inhibitor treatment could significantly inhibit the expression of these genes,and the inhibitory effect of MSLZ was slightly stronger than that of Let-7i-5p pared with the control group,the mRNA levels of IL-1βand TNF-αin colon tissues and the protein levels in serum of mice in the model group were significantly upregulated.MSLZ and Let-7i-5p inhibitor treatment could inhibit the expres-sion levels of IL-1βand TNF-α.Conclusion:In the TNBS/ethanol-induced UC mouse model,MSLZ can inhibit the expression of Let-7i-5p in colon tissues and serum.In addition,MSLZ can also inhibit the release of inflammatory factors by inhibiting the TLR4/MyD88-dependent pathway in UC mice.ʌKey wordsɔ㊀Ulcerative colitis;㊀Mesalazine;㊀Let-7i-5p;㊀TLR4/MyD88-dependent pathway㊀㊀溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病(IBD),与自身免疫性异常密切相关[1]㊂目前,氨基水杨酸㊁类固醇激素和免疫抑制是治疗UC最常用的药物[2]㊂然而,这些药物的治疗效果并不令人满意㊂此外,长期使用甚至会导致严重的不良反应㊂美沙拉嗪(MSLZ)作为一种新型的5-氨基水杨酸控释制剂,是UC治疗的首选药物[3]㊂特别适用于不能耐受柳氮磺胺吡啶的UC患者的急性发作㊂MSLZ的具体药理功能尚未完全阐明㊂有研究表明,MSLZ主要作用于肠道炎症黏膜,从而抑制前列腺素和白三烯的合成[4]㊂MSLZ清除氧自由基,抑制肠黏膜内脂肪酸,降低肠道通透性㊂同时,它对肠壁炎症具有显著的抗炎作用[5]㊂然而, MSLZ对免疫系统的调节作用却鲜有报道㊂有研究表明,MSLZ下调了结肠组织中核因子kappaB(NF-κB)的表达,从而减少了结肠中炎症细胞因子的产生[6]㊂此外,其他细胞因子或通路也可能参与了MSLZ的抗㊃055㊃炎调控㊂目前,Toll样受体4/髓系分化初级反应88 (TLR4/MyD88)依赖的信号通路在UC的发病机制中受到广泛关注[7]㊂在UC中存在许多差异表达的miR-NA,包括Let-7i-5p㊂在血红素诱导的炎症模型中,负载Let-7i-5p的脂质体靶向并减少TLR4的表达,从而产生抗炎信号传导㊂在本研究中,我们首先建立了2, 4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导的小鼠UC模型㊂我们的目的是检测MSLZ对UC的抗炎作用,并阐明Let-7i-5p和TLR4/MyD88依赖的通路是否参与了这一过程㊂本研究结果可为MSLZ治疗UC提供理论依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀动物和分组:44只雄性特异性无病原体(SPF) C57BL/6小鼠,体重(18ʃ2)g,购自北京维通利华有限公司,常规喂养一周后进行后续实验㊂将小鼠随机分为正常对照组㊁模型组㊁美沙拉嗪组和Let-7i-5p抑制剂4组,每组11只小鼠㊂在造模成功后,美沙拉嗪组小鼠连续14d灌胃30.8g/kg美沙拉嗪(MSLZ缓释颗粒;商品号:艾迪莎)㊂Let-7i-5p抑制剂组小鼠在造模前连续5d腹腔注射20mg/kg Let-7i-5p抑制剂(MH10211,Thermo Fisher Scientific,MA,c USA)㊂每天观察小鼠的活动情况㊁毛发颜色和粪便情况㊂1.2㊀试剂和仪器:5%2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS, Sigma-Aldrich,USA);10%水合氯醛(上海生物医学实验室有限公司);无水乙醇(杭州龙山化学有限公司);中心静脉导管(上海京医疗器械有限公司);Let-7i-5p引物(上海生物医学实验室有限公司);TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6㊁NF-κB㊁TNF-α和IL-1β引物(TaKaRa,日本);抗体β-actin和NF-κB(Cell Signa-ling Technology,美国);TLR4㊁MyD88和TRAF-6(Ab-cam,美国);二抗和电泳仪(Bio-Rad,美国);RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(TaKaRa,日本);实时PCR 系统(Applied Biosystems,美国)㊂1.3㊀小鼠UC模型的构建:每组小鼠注射10%3mL/ kg水合氯醛进行麻醉㊂用石蜡油润滑的深静脉导管缓慢插入距肛门约8cm处的结肠㊂模型组㊁MSLZ组和Let-7i-5p抑制剂组小鼠分别采用0.02mL/kg5% TNBS+0.25mL50%乙醇进行结肠裂解㊂而对照组小鼠接受等剂量生理盐水溶解㊂溶肠结束时推0.3mL 空气,用棉签堵塞小鼠肛门㊂轻揉小鼠腹部1min后倒置5min㊂随后小鼠正常饮食㊂小鼠UC模型的成功构建的评估标准如下:模型构建后2d内,小鼠出现精神疲劳㊁毛发无光泽㊁萎蔫㊁懒惰和进食减少的症状㊂此外,小鼠腹泻和排便频率增加,肛周皮毛粘稠,粪便中有脓液和血㊂1.4㊀实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR):采用TR-Izol(Invitrogen,美国)法提取结肠组织中的总RNA㊂按照PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa,日本)的说明进行逆转录㊂qRT-PCR严格按照SYBR Premix Ex Taq TM(TaKaRa,日本)进行㊂具体的qRT-PCR程序为:在95ħ预变性30s,然后在95ħ预变性40次循环5s,在60ħ退火和延伸30s㊂采用2-әәCt法计算其相对基因表达量㊂所用的引物序列如表1㊂表1㊀实时荧光定量PCR反应引物序列基因Gene引物序列Primer sequence(5'-3')β-actin F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAR:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG Let-7i-5p F:ACACTCCAGCTGGGTGAGGTAGTAGTTTR:TGGTGTCGTGGAGTCGTLR4F:CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTAR:GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC MyD88F:TATACCAACCCTTGCACCAAGTCR:TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC TRAF-6F:TTTGGCGTCGGAGACACTTGR:TTTGGCGTCGGAGACACTTGNF-ΚB F:CATGCGTTTCCGTTACAAGTGR:GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTGCT TNF-αF:TCAGTTCCATGGCCCAGACR:GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATTIL-1βF:CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCAR:CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA1.5㊀蛋白质印迹法:裂解结肠组织以获取总蛋白,然后测定总蛋白浓度㊂等量的蛋白质样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Billeri-ca,美国)㊂用脱脂牛奶封闭后,将PVDF膜与一抗(Cell Signaling Technology,美国)在4ħ下孵育过夜㊂第2天,将PVDF膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育2~3h㊂最后,使用增强化学发光(ECL)试剂(Thermo Fisher Scientific,美国)观察蛋白㊃155㊃质条带㊂利用Image J 软件进行定量光密度分析㊂1.6㊀免疫组化:采用免疫组化法检测结肠组织中TLR4和NF -κB 在结肠组织中的表达情况㊂结肠组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度4μm 进行免疫组化染色㊂在二甲苯孵育和乙醇浓度下降后,用柠檬酸缓冲液在100ħ下提取抗原15min ㊂内源性过氧化物酶在室温下通过3%过氧化氢去除,然后在37ħ下用5%山羊血清阻断㊂随后,切片与兔抗鼠或抗人TLR4和NF -κB (Santa Cruz Biotechnology ,Santa Cruz ,美国)一抗在最佳浓度下孵育过夜,然后在37ħ下与HRP 偶联的二抗孵育㊂最后,切片使用苏木精染色并在上升浓度的乙醇中脱水,在二甲苯中清除㊂使用显微镜((Olympus Corporation ,日本)采集图像㊂1.7㊀ELISA 检测小鼠血清中IL -1β和TNF -α的水平:每组小鼠眼眶取血,室温放置2h 后离心收集血清㊂IL -1β和TNF -α的含量按照ELISA (Thermo FisherScientific ,美国)试剂盒中的操作说明书进行测定㊂1.8㊀统计分析:采用Graphpad prsim8.0软件进行统计处理及作图,数据在进行正态性检验后以均数ʃ标准差( xʃs)表示,组间比较采用T 检验㊂P <0.05认为差异具有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀美沙拉嗪抑制溃疡性结肠炎小鼠Lei -7i -5p 的表达:qRT -PCR 结果显示,模型组小鼠结肠组织中和血清中Lei -7i -5p 的表达明显高于对照组(P <0.001),表明溃疡性结肠炎导致Lei -7i -5p 的上调㊂而MSLZ 或Lei -7i -5抑制剂处理后,与模型组相比,Lei -7i -5p 的表达明显受到抑制(P <0.001,图1A -B ),这说明美沙拉嗪可能通过调控Lei -7i -5p 的表达治疗溃疡性结肠炎㊂图1㊀美沙拉嗪抑制溃疡性结肠炎小鼠Lei -7i -5p 的表达(n =11)A ㊁qRT -PCR 检测小鼠结肠组织中Lei -7i -5p 的表达量㊂B ㊁qRT -PCR 检测小鼠血清中Lei -7i -5p 的表达量㊂与模型组相比,∗∗∗∗P<0.00012.2㊀美沙拉嗪通过调控Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状:溃疡性结肠炎小鼠体重随着时间的增加显著下降,但经MSLZ 和Lei -7i -5抑制剂治疗后体重下降减慢,体重显著高于模型组(P <0.0001和P<0.001)(图2A )㊂从疾病活跃指数(DAI )评分可以看出MSLZ 和Lei -7i -5抑制剂组显著的改善了小鼠溃疡性结肠炎,与模型组相比DAI 评分显著下降(P<0.0001)(图2B )㊂根据小鼠结肠HE 染色结果,模型组小鼠粘膜上皮损伤和腺体变形,组织学损伤评分高于正常对照组(P <0.0001)㊂MSLZ 组和Lei -7i -5抑制剂组粘膜上皮组织完整,腺体排列有序,组织学损伤评分均低于模型组(P <0.0001)(图2C -D )㊂以上结果说明抑制Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状㊂图2㊀美沙拉嗪通过调控Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状(n =11)A ㊁小鼠体重变化㊂B ㊁疾病活跃指数评分㊂C ㊁小鼠结肠组织HE 染色㊂D ㊁小鼠结肠组织的组织学损伤评分㊂与模型组相比,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.0001㊃255㊃2.3㊀美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4/MyD88依赖通路中相关基因的表达:为了探究Let-7i-5p在美沙拉嗪治疗小鼠溃疡性结肠炎中的作用机制,通过qRT-PCR检测了小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平㊂结果表明,模型组的TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-kB的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.0001);MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.0001),但仍高于正常对照组(图3A-D)㊂此外,通过Western blot检测了各组结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB蛋白水平㊂与对照组相比,模型组中上述基因的蛋白表达水平显著升高(P<0.01),MSLZ和Lei-7i-5抑制剂治疗后各蛋白水平的表达显著低于模型组(P<0.01)(图3E-F),但仍高于正常对照组㊂最后,通过免疫组化检测了小鼠结肠组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达水平㊂模型组中TLR4和NF-κB的表达显著高于正常对照组,MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TLR4和NF-κB的表达显著低于模型组,但仍高于正常对照组,且MSLZ组对以上两种蛋白的抑制效果高于Lei-7i-5抑制剂组(图3G-H)㊂以上结果说明美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4/MyD88依赖通路中相关基因的表达㊂图3㊀美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4和MyD88的表达(n=11)A-D㊁qRT-PCR检测各组小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平㊂E-F㊁Western blot检测各组小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的蛋白表达水平㊂G-H㊁免疫组化染色检测各组小鼠结肠组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达水平㊂与模型组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.00012.4㊀美沙拉嗪抑制了溃疡性结肠炎小鼠中炎症因子的表达:通过qRT-PCR检测了小鼠结肠组织中TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平㊂结果表明,模型组的TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.0001),MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.0001),但仍高于正常对照组(图4A-B)㊂进一步的又检测了小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达水平,也得到了同样的结果,模型组的TNF-α和IL-1β的表达水平均高于对照组(P<0.0001),而MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后这两种蛋白的表达量相比于模型组显著下降(P<0.0001)(图4C-D)㊂㊃355㊃图4㊀美沙拉嗪抑制了溃疡性结肠炎小鼠中炎症因子的表达(n =11)A -B ㊁qRT -PCR 检测各组小鼠结肠组织中TNF -α和IL -1β的mRNA 表达水平㊂C -D ㊁ELISA 检测各组小鼠血清中TNF-α和IL -1β的表达水平㊂与模型组相比,∗∗∗∗P<0.00013㊀讨㊀论UC 是一种慢性复发性或持续性结肠炎症性疾病,其典型发病特征包括腹痛㊁腹泻和便血[1]㊂随着人类生活节奏的加快和生活方式的改善,UC 的发病率在中国不断上升㊂但其具体发病机制尚不清楚,研究表明UC 与遗传㊁饮食和环境因素㊁肠道菌群紊乱和免疫屏障相关[8]㊂美沙拉嗪常用于UC 的治疗,但其确切的治疗机制还需进一步的研究㊂Toll 受体是一种模式识别受体,TLR4介导先天防御反应,主要识别细菌脂多糖,被刺激后激活MyD88因子和下游转录因子NF -κB ,进一步刺激炎症因子的释放和分泌[6]㊂有研究表明UC 小鼠MyD88蛋白的表达水平与炎症程度呈正相关[9],提示调节TLR4/MyD88/NF -κB 信号通路在UC 的发生和发展中起着至关重要的作用㊂因此,开发能够靶向和调控TLR4/MyD88/NF -κB 信号通路的药物是一个迫切有待解决的问题㊂近年来,miRNAs 已成为医学领域的研究热点,随着对基因组的深入研究,人们发现非编码RNA 也会影响编码蛋白的合成㊂最初的miRNAs 在细胞核中被Drosha 酶裂解成前体miRNAs ,后者通过将蛋白质从细胞核运输到细胞质而转移㊂它们被Dicer 酶切割成具有20-25个核苷酸大小的miRNAs ㊂成熟的miRNAs 可以结合到3'非翻译区位点,从而调控基因编码㊂这引起了学者们的关注,越来越多的研究证实了miRNA 在UC 患者的血清㊁结肠组织和粪便中的异常表达㊂我们认为这些异常表达的miRNAs 可导致UC 的发生发展或加重疾病㊂在对19例UC 患者进行研究时,Lin 等通过miRNAs 筛选发现,miR -147b ㊁miR -194-2㊁miR -383㊁miR -615㊁miR -1826与正常人相比表达存在差异,其调控机制可能与TGF -β㊁STAT3㊁IL -8和PI3K /AKT /mTOR 信号通路有关㊂通过基因治疗靶向调控差异表达miRNAs 的研究将为UC 提供新的研究思路和治疗方案㊂本研究采用TNBS /乙醇诱导的小鼠UC 模型进行实验㊂该体内模型与人类UC 相似,具有病程长㊁操作简单㊁成本效益高㊁实用性强㊁重复性好等优点㊂模型组小鼠血清和结肠组织中Let -7i -5p 高表达,且结肠组织病理损伤较对照组更严重,表现有结肠粘连㊁稀便㊁便血等症状㊂而美沙拉嗪和Let -7i -5p 抑制剂治疗后大鼠结肠粘附和出血均有改善㊂为进一步研究美沙拉嗪通过Let -7i -5p 对UC 小鼠的调控作用,我们检测了TRL4㊁MyD88㊁TRAF -6和NF -κB 的表达水平,以了解UC 小鼠中TLR4/MyD88通路的变化㊂此外,我们还测定了IL -1β和TNF -α的水平,以阐明TLR4/MyD88通路对UC 诱导的炎症反应的调控作用㊂Western blot 和qRT -PCR 结果显示,模型组小鼠中TRL4㊁MyD88㊁TRAF -6和NF -κB 的mRNA 和蛋白水平均显著高于对照组㊂这提示了TLR4/MyD88依赖通路在UC 中的特定作用㊂此外,MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理后下调了这些基因的表达,特别是在蛋白水平上㊂模型组的炎症因子IL -1β和TNF -α的mR-NA 和蛋白水平均显著高于正常对照组㊂MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理均能抑制其在UC 小鼠中的表达水平㊂MSLZ 对UC 小鼠的治疗效果与Let -7i -5p 抑制剂不完全一致,说明MSLZ 通过Let -7i -5p /TLR4/MyD88信号通路治疗UC 的这一机制,与之前报道的MSLZ 治疗UC 的机制可能存在部分交际㊂Let -7i -5p /TLR4/MyD88信号通路是否能够调控前列腺素和㊃455㊃白三烯的合成,以及对氧自由基和肠黏膜内脂肪酸的调控需要进一步的研究㊂总之,我们的研究结果表明,在TNBS /乙醇诱导的UC 小鼠模型中,MSLZ 可以抑制小鼠血清和结肠组织中Let -7i -5p 的表达㊂此外,MSLZ 通过抑制UC 小鼠的TLR4/MyD88依赖通路来抑制炎症因子的释放㊂ʌ参考文献ɔ[1]㊀CLE Berre ,S Honap ,L Oeyrin -biroulet.Ulcerative colitis[J ].Lancet ,2023,402(10401):571-584.[2]㊀M Naganuma ,S Mizuno ,K Nanki ,et al.Recent trends andfuture directions for the medical treatment of ulcerative [J ].Clin Gastroenterol ,2016,9(6):329-336.[3]㊀PM Veoso ,R Machado ,C Nobre.Mesalazine and inflammato-ry bowel disease -from well -established therapies to progress beyond the state of the art [J ].Eur Pharm Biopharm ,2021(167):89-103.[4]㊀OH Nielsen ,LK Munck.Drug insight :aminosalicylates forthe treatment of IBD [J ].Nat Clin Pract Gastroenterol Hep-atol ,2007,4(3):160-170.[5]㊀C LE Berre ,G Roda ,M Nedeljkovic Protic ,et al.Modern useof 5-aminosalicylic acid compounds for ulcerative colitis[J ].Expert Opin Biol Ther ,2020,20(4):363-378.[6]㊀Q Wang ,Y Hou ,D Yi ,et al.Protective effects of N -acetyl-cysteine on acetic acid -induced colitis in a porcine model [J ].BMC Gastroenterol ,2013,13(133):133.[7]㊀JM Gonzalez -navajas ,S Fine ,J Law ,et al.TLR4signaling ineffector CD4+T cells regulates TCR activation and experi-mental colitis in mice [J ].Clin Invest ,2010,120(2):570-581.[8]㊀RA Gupta ,MN Motiwala ,NG Dumore ,et al.Effect of piper-ine on inhibition of FFA induced TLR4mediated inflamma-tion and amelioration of acetic acid induced ulcerative colitisin mice [J ].Ethnopharmacol ,2015,164:239-246.[9]㊀M Chamanara ,A Rashidian ,SE Mehr ,et al.Melatonin amel-iorates TNBS -induced colitis in rats through the melatonin receptors :involvement of TLR4/MyD88/NF -κB signalling pathway [J ].Inflammopharmacology ,2019,27(2):361-371.ʌ文章编号ɔ1006-6233(2024)04-0555-06PKGIα通路抑制剂DT -3对胃癌细胞增殖和迁移的影响张秀芬1,㊀潘理会2,㊀李春辉1(1.承德医学院附属医院病理科,㊀河北㊀承德㊀0670002.承德医学院,㊀河北㊀承德㊀067000)ʌ摘㊀要ɔ目的:探讨PKGIα信号通路特异性抑制剂DT -3对胃癌细胞增殖和迁移的影响㊂方法:利用生物信息学分析,基于GEO ㊁TCGA ㊁HPA ㊁Kaplan -Meier plotter 数据库和GEPIA 在线分析网站对PKGI 在组织中的表达进行差异分析并探讨PKGI 和PKGIα在胃癌患者中的预后情况㊂采用CCK -8㊁克隆形成实验检测DT -3对细胞增殖的影响,划痕愈合实验观察DT -3对细胞迁移的影响;Western blot-ting 法验证PKGIα的蛋白表达和相关性分析㊂结果:胃腺癌组织中PKGI mRNA 表达增高,在42种胃癌细胞株里有27种能检测到PKGI mRNA 的表达,高表达PKGIαmRNA 的胃癌组织更具肿瘤侵袭性;免疫组织化学(IHC )结果展示PKGI 蛋白表达情况,12例胃癌组织中观察到6例存在中㊁高强度的细胞质染色阳性反应;PKGI 和CDH1的表达呈负相关(r =-0.74,P <0.05);生存分析显示PKGI 和PKGIαmRNA 高表达对胃腺癌患者的总生存期(OS )有统计学意义(HR>1,logrank P <0.05)㊂实验结果表明PKGIα蛋白在人胃癌细胞株AGS 中的表达增加;DT -3抑制细胞增殖迁移(P <0.05),使NF -κB 磷酸化p65表达降低,且PKGI 和NF -κB p -p65的表达呈极强正相关(r =0.957,P <0.05)㊂结论:通过抑制PKGIα信号通路,可以有效抑制胃癌细胞增殖迁移㊂ʌ关键词ɔ㊀PKGIα通路;㊀DT -3;㊀NF -κB p -p65;㊀生物信息学分析;㊀胃癌细胞AGS ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoi ɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2024.04.05Signaling Pathway by DT -3a Inhibitor of the PKGIαPathway on Proliferationand Migration of Gastric Cancer Cells㊃555㊃ʌ基金项目ɔ2022年承德市科技计划自筹经费项目(第三批),(编号:202204A027)ʌ通讯作者ɔ李春辉。
小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与评价曹明泽;王旭荣;王磊;张景艳;王海瑞;李建喜;王学智【摘要】本试验旨在通过筛选葡聚糖硫酸钠盐(DSS)最佳浓度建立小鼠溃疡性结肠炎模型.将30只BALB/c小鼠随机分为对照组、3.5％DSS组、5％DSS组,每组10只.小鼠自由饮水5d,每天记录小鼠体重,观察粪便性状,测便潜血.试验结束后测血清TNF-α、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)活性变化等指标,计算结肠重量/长度比值.与对照组相比,两试验组结肠组织中MPO 活性显著升高(P＜0.05),MDA含量显著升高(P＜0.05),GSH含量显著降低(P＜0.05).结果表明,两种浓度葡聚糖硫酸钠盐均可造模成功,5％ DSS组小鼠精神状态很差,表现嗜睡、萎靡状态,而3.5％DSS组小鼠精神状态良好,且组织中MPO、MDA、GSH与对照组相比均差异显著(P＜0.05),与5％ DSS组相比差异不显著(P ＞0.05),因此,选用浓度为3.5％ DSS造模更合适.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)001【总页数】5页(P171-175)【关键词】溃疡性结肠炎;疾病活动指数;TNF-α;髓过氧化物酶;丙二醛;还原型谷胱甘肽【作者】曹明泽;王旭荣;王磊;张景艳;王海瑞;李建喜;王学智【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R574.62炎症性肠病(IBD)是一种慢性、复发性、非特异性肠道炎症疾病，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)两个独立的疾病，二者在临床表现和病理特点上各不相同。
