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武汉植物学研究2003,21(2):179～186J ourna l of W uhan B otan ica l R esea rch获取全长cD NA若干方法的比较陶爱林,林兴华,张端品Ξ(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉 430070)关键词:全长c DNA;信使RNA;5′帽子结构;高保真PCR;比较 中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:10002470X(2003)022******* Com par ison of the Approaches for Full-length cD NA Enr ichm en tTAO A i2L in,L I N X ing2H ua,ZHAN G D uan2P in(N a tiona l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rove m en t,H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity,W uhan 430070,Ch ina) Abstract:Fu ll2length com p lem en tary DNA s(c DNA)are crucial fo r the functi onal anno tati on of genes.Several novel exp eri m en tal app roaches fo r selective en richm en t of fu ll2length c DNA s are ou tlined in parallels.Som e k inds of reverse tran scri p tases and h igh fidelity PCR enzym es are in2 troduced fo r p rom ising h igh efficiency of accu rate fu ll2length c DNA syn thesis.T he tem p eratu re p rofiles of the reverse tran scri p ti on and PCR are also discu ssed.Key words:Fu ll2length c DNA;m RNA;5′2CA P;H igh2fidelity PCR;Com parison 生物技术突飞猛进大大提高了人类认识自身及与人类息息相关的生命现象的能力。
CDNA法是一种基因克隆技术，它通过合成RNA的互补DNA链来获取特定基因的DNA序列。
下面我们将介绍一个科学家在使用CDNA法获得目的基因的故事，展示了这一技术在生命科学领域的重要应用。
一、科学家背景这位科学家名叫李明，是一位优秀的分子生物学家。
他在大学时就展现出对生物学的浓厚兴趣，毕业后前往美国一家知名的生物技术公司工作。
在这家公司，李明深入研究了CDNA法的原理和应用，并成功地利用该技术克隆了多个目的基因。
二、CDNA法的原理CDNA法是一种重要的基因克隆技术，它利用了生物体中DNA的转录和逆转录过程。
具体来说，CDNA法通过以下步骤获得目的基因的DNA序列：1. 提取RNA：从目的细胞或组织中提取总RNA。
这一步需要严谨的实验操作，以确保RNA的完整性和纯度。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转录成互补的DNA链，即cDNA。
这是CDNA法的关键步骤，也是其得名的原因。
3. 克隆cDNA：将得到的cDNA插入到适当的载体中，经过转化、筛选等步骤，最终获得目的基因的克隆。
三、科学家故事李明在公司工作期间，获得了一个重要的研究项目：克隆一种与人类疾病相关的基因。
这个基因对研究某种遗传疾病的发病机制非常重要，因此克隆它具有重要的科学意义和潜在的医学应用价值。
在这个项目中，李明首先需要获取这种基因的DNA序列，并将其插入适当的表达载体中，以便在细胞中表达其蛋白。
通过查阅文献和分析公开数据库，李明确定了这种基因在人类组织中的表达模式和序列信息，然后开始着手使用CDNA法进行克隆。
他从实验室中获得了大量的人类细胞系，并提取了其中的总RNA。
这一步骤需要精密的实验技术和仪器，以确保RNA的完整性和纯度。
经过多次尝试和改进，李明终于获得了满意的RNA样本。
他使用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。
由于目标基因的转录水平并不高，在这一步骤中需要特别小心地选择适当的引物和反应条件。
经过一段时间的努力，李明成功地得到了目的基因的cDNA序列，并将其插入了表达载体中。
拟南芥全长cDNA研究进展【摘要】全长cdnas是基因组序列注释和基因及其产物功能分析的基础。
目前共分离了155，144个riken拟南芥全长（raf）cdna 克隆。
将得到的155，144个rafl cdnas进行了3’端表达序列标签聚类成14，668个非冗余cdna类，其中60%预测到基因。
同时已从14，034个非冗余cdna类中获得了5’ests，并构建成启动子文库。
rafl cdnas序列数据库的建立有助于启动子分析、预测出转录本单元的正确注释和基因产物的注释。
而且，全长cdnas还为表达谱分析、功能分析和植物蛋白结构分析提供了宝贵的资源。
【关键词】拟南芥；cdna拟南芥因其具有个体小，世代周期短和转化率高等特点，因此在植物研究中被广泛的作为一种模式生物。
为了将拟南芥的小基因组测序，日本、欧洲和美国的科学家共同合作完成了拟南芥基因组测序工程。
拟南芥5条染色体中的2条（2号和4号染色体，不包括核仁组织区和着丝点区）在1991年进行了测序，其余3条染色体在2000年进行了测序。
2001年5月，大约127，000个拟南芥表达序列标签（ests）被提交到est数据库（dbest）。
其中的序列来自法国，美国和日本共同合作的大范围est工程。
这些工程已从不同的组织、器官、种子和发育阶段的拟南芥中获得est数据。
然而，这些基于cdna文库的est工程中的大部分的插入片段都不是全长的。
ests有助于为表达基因提供标签，大圣无法进行基因功能的进一步研究。
因此，全基因组范围的获得表达基因的全长cdna，对于在功能基因组学领域中分析基因及其产物的表达标签和功能是十分重要的。
1.拟南芥全长cdna文库的构建目前已应用biotinylated cap trapper法建立了拟南芥的全长cdna文库。
最近，研究人员有将trehalose-ther-moactivated 反转录酶应用到cap trapper法中，构建了不同处理的拟南芥全长cdna文库。
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
