8目的基因的克隆

第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。

2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。

3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。

二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。

克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。

2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。

3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。

4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。

5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。

6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。

三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。

2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。

四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。

2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。

《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。

4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。

其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。

载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。

主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。

载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。

质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。

最常用的质粒是pBR322。

基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。

其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。

cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。

cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。

特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。

核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。

获得大量目的基因的方法有哪些
获得大量目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增：利用特定引物对目的基因进行扩增，从而获得大量目的基因。

这种方法需要已知目的基因序列信息作为PCR引物的设计依据。

2. 基因克隆：将目的基因插入载体（如质粒或噬菌体），然后通过细菌转化等方法在大量细胞中复制目的基因。

3. 多聚酶链式反应（multiplex PCR）：通过引物的多元化设计，在一次PCR反应中同时扩增多个目的基因。

4. 筛选基因库：对具有某种特定基因组或基因片段的大量细胞进行筛选，从中得到大量目的基因。

5. 基因合成：利用化学合成的方法，按照目的基因的序列信息合成完整的目的基因。

6. 基因放大：通过使用细胞系或者动物模型等方法，人工放大目的基因以获得大量目的基因。

需要注意的是，以上方法适用于不同的研究目的和实验条件，选择合适的方法需
要考虑实验要求、操作难度、成本等因素。

第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。

本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。

2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。

四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。

（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。

2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。

（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。

3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。

（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。

4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。

（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。

5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。

（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。

（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。

全长基因的克隆王闵霞　马欣荣　代富英　谭　红(中国科学院成都生物研究所,成都610041)摘　要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。

本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。

关键词:全长基因　克隆　文库筛选法　PCR　电子克隆The Cloning of Entire G eneWANG Minxia　MA Xinrong　DAI Fuying　TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041)Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng.K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。

随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。

一、实验目的1. 理解基因克隆的基本原理和操作步骤。

2. 掌握限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒载体等工具的使用方法。

3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA中，构建重组DNA分子，并在宿主细胞中扩增。

实验过程中，主要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具进行DNA片段的切割、连接和转化。

三、实验材料与仪器1. 材料：质粒载体、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、DNA琼脂糖凝胶电泳试剂盒、DNA纯化试剂盒、感受态细胞等。

2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机、培养箱、超净工作台等。

四、实验步骤1. 制备DNA模板：以质粒载体为模板，利用PCR技术扩增目的基因片段。

2. 酶切：将目的基因片段和质粒载体分别用限制性核酸内切酶进行酶切，得到具有相同粘性末端的DNA片段。

3. 连接：将酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA连接酶的作用下连接成重组DNA分子。

4. 转化：将重组DNA分子转化到感受态细胞中，使其成为重组质粒。

5. 鉴定：通过PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对转化后的细胞进行鉴定，筛选出含有目的基因的克隆。

6. 提取目的基因：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行DNA纯化。

7. 验证：利用DNA测序技术对提取的目的基因进行验证，确保其序列与预期一致。

五、实验结果与分析1. 酶切：酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出两条带，分别对应目的基因片段和质粒载体。

2. 连接：连接产物在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因片段和质粒载体已成功连接。

3. 转化：转化后的细胞在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明转化成功。

4. 提取目的基因：提取的重组质粒在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因已成功提取。

5. 验证：DNA测序结果显示，提取的目的基因序列与预期一致，实验成功。