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广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金检测试纸条的研制及应用黄瓜花叶病毒是一种在广东烟区常见的植物病毒，会导致黄瓜植株叶片变黄、变小，严重的话还会影响其产量和品质。
早期发现和及时诊断黄瓜花叶病毒对黄瓜种植具有重要意义。
为了解决这个问题，我们进行了广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金检测试纸条的研制及应用研究。
我们选择了胶体金作为检测黄瓜花叶病毒的试剂，在测试纸条上添加了与黄瓜花叶病毒相关的抗原，结合胶体金的颜色变化原理，通过比较纸条的颜色差异来判断黄瓜植株是否被感染。
在研制过程中，我们首先提取了黄瓜花叶病毒的核酸，并将其与抗原结合，制备了具有特异性的抗原溶液。
然后，将抗原溶液与胶体金颗粒混合，形成胶体金-抗原复合物。
将复合物滴在试纸条上，干燥后即可使用。
在应用方面，我们在广东烟区的黄瓜种植基地进行了实地测试。
我们收集了来自不同黄瓜植株的叶片样品，并将其按照感染程度分为健康、轻度感染和重度感染三组。
然后，在每组样品中使用我们研制的试纸条进行检测，记录纸条的颜色变化。
我们的结果显示，与健康植株相比，黄瓜花叶病毒感染植株的试纸条会呈现出不同程度的颜色变化。
特别是在重度感染组中，试纸条的颜色变为深红色，而健康组和轻度感染组的试纸条仍然保持原色。
通过对比颜色变化，我们可以准确地判断黄瓜植株是否被黄瓜花叶病毒感染，为及时采取治疗措施提供了科学依据。
我们还测试了试纸条的灵敏度和特异性。
结果表明，我们研制的试纸条对黄瓜花叶病毒具有较高的灵敏度和特异性，能够准确地检测到不同浓度的黄瓜花叶病毒。
我们的试纸条对于其他与黄瓜花叶病毒不相关的病毒具有较高的特异性，避免了误判和漏诊。
我们的研究成功地研制出了广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金检测试纸条，并在实际应用中取得了良好的效果。
通过使用我们研制的试纸条，可以快速、准确地检测黄瓜植株是否被黄瓜花叶病毒感染，为黄瓜种植管理提供了便利和支持。
希望我们的研究能够为相关领域的科研人员和农业从业者提供参考和借鉴。
中文名称:甜(辣)椒病毒病英文名称:中文别名:拉丁学名:黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)为害作物:为害症状:由于病毒种类不同，田间症状也多种多样，主要症状有三种类型即花叶型、坏死型和丛枝型，以花叶型最为普遍，坏死型为害最严重。
花叶型在田间表现最早，嫩叶叶脉呈半透明状，以后沿叶脉褪绿，呈浅绿与深绿相间的花叶状，严重时叶脉间有浓绿的疱斑，叶片窄小，增厚，叶缘卷曲，畸形，叶柄弯曲，易落叶。
有的品种叶片上有大型黄绿色、周缘暗绿色蚀纹状环斑。
有的病斑后期变为褐色或黑褐色，并破裂。
果实上呈现浅黄色至浅褐色的花斑，或瘤状突起，果小，肉薄，僵硬，严重时全果发黄，仅有少量绿色部分，或畸形。
坏死型较花叶发生晚，叶脉上现褐色或黑褐色坏死斑点或短条斑，有时叶脉呈褐色网状，坏死症沿叶脉向叶柄、果柄、侧枝、主茎发展，形成明显的长短不一的黑褐色坏死条斑，维管束变褐，造成大量落叶、落花、落果，嫩枝、生长点坏死，以致全株枯死。
丛枝型的病株，长势弱，节间缩短，枝条明显缩短、丛生，叶细小，色浅，植株显著矮化呈丛簇状，结果少或不结果。
病原菌形态特征:黄瓜花叶病毒是甜(辣)椒上最主要的病原病毒，占病株样本的50％以上，在甜(辣)椒上引起系统性花叶、蕨叶、果实畸形坏死、矮化、茎部条斑等症状。
烟草花叶病毒为第二位病原病毒，约占病株样本的30％。
其余病原病毒有马铃薯Y病毒(PVY)、苜蓿花叶病毒、(AMV)、辣椒斑驳病毒(PeMV)等。
分类属性:分布区域:我国各地都有发生发病特点:高温干旱，过强的日照有利于蚜虫繁殖传毒，不利于甜(辣)椒生长，降低了寄主的抗病性，因而病害发生较重。
烟草花叶病毒等靠接触传染的病毒，通过整枝打杈等作业及残留在土中的病残传播。
定植晚，连茬种植，管理粗放的地块病害重。
南方菜区周年可种植甜(辣)椒，病毒病发生时间长，病情重。
长江流域5、6月，华北地区6、7月，东北、西北7月中至8月中，病害发生较重。
流行动态:防治方法:(1)选用抗病品种一般尖椒、锥形椒较灯笼形甜椒抗病。
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(６):１３６~１４２ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０６.０１８收稿日期:２０２２－０７－０６基金项目:河南省烟草公司平顶山市公司科技项目(ＰＹＫＪ２０２２０７)作者简介:郭玉鸽(１９９７ )ꎬ女ꎬ河南洛阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:烟草遗传育种与品质改良ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｇｕｏｙｕｇｅ３３＠１６３.ｃｏｍ通信作者:武兆云(１９７９ )ꎬ男ꎬ安徽马鞍山人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事烟草遗传育种与品质改良研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｚｈａｏｙｕｎ＠ｈｅｎａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ阎海涛(１９８４ )ꎬ男ꎬ河南荥阳人ꎬ博士ꎬ农艺师ꎬ从事土壤改良及烟草栽培研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｈｔ５６５７＠１６３.ｃｏｍ基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病郭玉鸽１ꎬ张倩１ꎬ杨惠娟１ꎬ李俊营２ꎬ常栋２ꎬ张富生２ꎬ武兆云１ꎬ阎海涛２ꎬ杨铁钊１(１.河南农业大学烟草学院ꎬ河南郑州㊀４５０００２ꎻ２.河南省烟草公司平顶山市公司ꎬ河南平顶山㊀４６７０００)㊀㊀摘要:黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎮ本试验通过病毒诱导基因沉默技术(ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)构建靶向沉默ＣＭＶ－１ａ㊁ＣＭＶ－２ａ㊁ＣＭＶ－ＭＰ和ＣＭＶ－ＣＰ的ＶＩＧＳ载体ꎬ测定基因沉默后ＣＭＶ相对表达量㊁ＣＭＶ病毒浓度和ＴＲＶ相对表达量ꎬ并对ＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的防治效果进行评价ꎮ结果表明ꎬ试验建立的ＶＩＧＳ载体能够有效导入烟株ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒３０ｄ后ＣＭＶ－２ａ处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎬＴＲＶ载体的相对表达量显著高于其他处理ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理发病时间推迟ꎬ病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因表达ꎬ抑制ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ关键词:ＶＩＧＳ技术ꎻ干扰病毒ＲＮＡꎻ烟草ꎻ黄瓜花叶病毒病中图分类号:Ｓ４３５.７２:Ｑ７８９㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０６－０１３６－０７ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＴｏｂａｃｃｏＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅｂｙＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＶｉｒａｌＲＮＡＢａｓｅｄｏｎＶＩＧＳＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｕｏＹｕｇｅ１ꎬＺｈａｎｇＱｉａｎ１ꎬＹａｎｇＨｕｉｊｕａｎ１ꎬＬｉＪｕｎｙｉｎｇ２ꎬＣｈａｎｇＤｏｎｇ２ꎬＺｈａｎｇＦｕｓｈｅｎｇ２ꎬＷｕＺｈａｏｙｕｎ１ꎬＹａｎＨａｉｔａｏ２ꎬＹａｎｇＴｉｅｚｈａｏ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｏｂａｃｃｏꎬＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎＢｒａｎｃｈｏｆＨｅｎａｎＴｏｂａｃｃｏＣｏｍｐａｎｙꎬＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ４６７０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｍｏｓａｉｃｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＣＭＶ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｉｓｅａｓｅｏｆｔｏｂａｃｃｏ.Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｓｅｄｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣１ａꎬＣＭＶ￣２ａꎬＣＭＶ￣ＭＰａｎｄＣＭＶ￣ＣＰ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶꎬｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣＭＶｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶａｆｔｅｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓａｇａｉｎｓｔＣＭＶｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｅｓ￣ｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃｏｕｌｄｂｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｓ４６.２５％.Ａｆｔｅｒ３０ｄａｙｓｏｆｖｉｒｕｓｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬｔｈｅＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｖｉｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｏｎｌｙ７２.８％ｏｆｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ.ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｌａｙｅｄｔｈｅｏｎｓｅｔｔｉｍｅａｎｄｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｅｘｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔꎬｓｏｉｔｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔ.ＴｈｅＣＭＶ￣２ａＶＩＧＳｓｙｓｔｅｍｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｓｉ￣ｌｅｎｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＣＭＶｇｅｎｅｓꎬａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＣＭＶｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｏｂａｃｃｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶＩＧＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎻＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｖｉｒａｌＲＮＡꎻＴｏｂａｃｃｏꎻＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ㊀㊀由黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎬ严重影响烟叶质量[１ꎬ２]ꎮ黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ)黄瓜花叶病毒属(Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒ￣ｕｓ)的典型成员ꎬ为三分体正义单链ＲＮＡ病毒[３]ꎬ编码５种蛋白[４]ꎮＲＮＡ１编码１ａ复制酶蛋白[５]ꎻＲＮＡ２的５ᶄ端编码２ａ复制酶蛋白ꎬ３ᶄ端编码２ｂ蛋白[６]ꎮ前人研究发现植物受ＣＭＶ侵染后的症状表现是由１ａ和２ａ复制酶蛋白共同决定的ꎬ二者具有协同作用[７]ꎮＲＮＡ３的５ᶄ端编码胞间运动蛋白(ＭＰ)ꎬ３ᶄ端编码外壳蛋白(ＣＰ)ꎬ与病毒扩散㊁长距离运输和包被作用有关[８]ꎮ目前生产上防治烟草黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主ꎬ容易造成药剂残留和环境污染等问题[９ꎬ１０]ꎮ培育抗病品种也是防治烟草黄瓜花叶病的有效方式之一[１１]ꎬ但至今还没有从烟草上克隆出ＣＭＶ抗性基因[１２]ꎬ育种工作进展缓慢ꎬ而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法[１３]ꎮ病毒诱导基因沉默(ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉ￣ｌｅｎｃｅꎬＶＩＧＳ)是一种对植物进行反向遗传操作的技术[１４]ꎬ是植物防御机制的表现[１５]ꎮ农杆菌介导的ＶＩＧＳ技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中[１６]ꎬ介导靶向同源基因的ｍＲＮＡ降解ꎬ引起目的基因沉默[１７]ꎮ烟草脆裂病毒(ＴｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓꎬＴＲＶ)载体是使用最广泛的ＶＩＧＳ载体ꎬ具有沉默效率高㊁持久性长㊁不会对宿主造成明显伤害等优点[１８]ꎮ目前ＶＩＧＳ技术多用于基因功能鉴定和抗病抗虫[１９ꎬ２０]研究上:如龚攀[２１]构建的甜菜ＶＩＧＳ体系验证了抗旱相关基因功能ꎻ刘天波等[２２]沉默马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系外壳蛋白基因有效防治马铃薯Ｙ病毒病ꎮ有研究表明ꎬＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因是不同的[２３]ꎮ因此本研究根据ＣＭＶ基因组及其编码蛋白的组成特征ꎬ构建靶向相关基因片段的ＴＲＶ载体ꎬ比较烟株接种ＶＩＧＳ载体后对ＣＭＶ的抗性ꎬ以期筛选适用于大田防治烟草黄瓜花叶病的最佳ＶＩＧＳ体系ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料试验于２０２２年４ ５月进行ꎮ参试烤烟品种为中烟１００ꎬ由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮｐＴＲＶ２载体购自武汉淼灵生物科技有限公司ꎬ根癌农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司ꎮＣＭＶ病毒叶片由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀引物设计㊀根据已测定的ＣＭＶ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＧＣＡ＿０００８６４７４５.１)序列ꎬ选取适合用来构建ＶＩＧＳ载体的片段ꎬ使用Ｏｌｉｇｏ７软件设计特异性引物ꎬ其序列如表１所示ꎮ㊀㊀表１㊀本研究使用的引物序列引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)扩增产物大小(ｂｐ)ＣＭＶ－１ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＣＴＧＣＧＧＡＴ￣ＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡ６８６ＣＭＶ－１ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＴＣ￣ＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＭＶ－２ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＴＡＡＡ￣ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧ５５３ＣＭＶ－２ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＴＣＴＣＴ￣ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＴＣＡＣＭＶ－ＭＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＧＴＣＧＴＡＴＴ￣ＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴ３０３ＣＭＶ－ＭＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＣＴＧＴＴＴＣ￣ＣＡＴＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＭＶ－ＣＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＡＡＧＡＣＧＴ￣ＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣ３６４ＣＭＶ－ＣＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＧＴＡＣＣＧＧＴ￣ＧＡＧＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＲＶ２－ＦＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴ￣ＧＣＣ７４４ＴＲＶ２－ＲＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＴ￣ＣＡＴＣ㊀㊀注:下划线部分为酶切位点ꎬ所用限制性内切酶为ＥｃｏＲⅠ㊁ＢａｍＨⅠꎬ酶切位点前的小写字母为保护碱基ꎮ１.２.２㊀ＶＩＧＳ载体的构建㊀利用ＴＲＩｚｏｌ法提取感染了ＣＭＶ病毒的烟叶总ＲＮＡꎬ参照北京全式金７３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病生物技术有限公司ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ说明书反转成ｃＤＮＡꎮ以获得的ｃＤＮＡ为模板ꎬ按照表１引物利用诺唯赞生物技术有限公司的Ｐ５０５高保真酶进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增体系:２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒ２５μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘ(１０ｍｍｏｌ/Ｌ)１μＬꎬＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬꎬ上下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各２μＬꎬｃＤＮＡ(２０μｍｏｌ/Ｌ)模版１μＬꎬｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬꎮ反应条件:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９５ħ变性１５ｓꎬ６８ħ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ终延伸５ｍｉｎꎬ琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收目的片段ꎮ对ｐＴＲＶ２空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ/ＢａｍＨⅠ双酶切后获得线性化载体ꎮ将扩增产物与线性化载体进行连接ꎬ随后转化至大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎮ将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存ꎮ１.２.３㊀重组表达载体转化㊀参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞的使用说明书ꎬ将重组表达载体ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮ将菌液均匀涂抹在ＬＢ(含有浓度为２５ｍｇ/ｍＬ利福平和５０ｍｇ/ｍＬ卡那霉素)固体培养基上ꎬ２８ħ下倒置培养４８ｈꎻ挑取单菌落经ＰＣＲ扩增后ꎬ使用琼脂糖凝胶电泳检测验证后分别扩繁ꎮ１.２.４㊀农杆菌转化烟草㊀将ｐＴＲＶ１㊁ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ分别接种到ＬＢ液体培养基上ꎬ２８ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ过夜培养后ꎬ调整浓度ＯＤ６００值为０.８~１.０ꎬ用ｐＴＲＶ１分别与ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ等比混合ꎬ离心后弃上清液ꎬ将沉淀重悬于等体积的侵染缓冲液(５０ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２㊁５０ｍｍｏｌ/ＬＭＥＳ㊁０.１ｍｍｏｌ/Ｌ乙酰丁香酮)中ꎮ选取长势均匀一致的六叶一心烟苗ꎬ用１ｍＬ注射器注射侵染液于烟株嫩叶背面ꎬ每株烟注射２片叶ꎬ每片叶注射１ｍＬꎮ１.３㊀试验设计共设置６个处理ꎬ分别为ＣＫ:不注射烟株ꎻ空载:注射接种含ｐＴＲＶ２的侵染液(空载体对照)ꎻＣ１:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ的侵染液ꎻＣ２:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ的侵染液ꎻＣ３:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ的侵染液ꎻＣ４:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ的侵染液ꎮ每个处理注射接种２０株烟ꎬ每株烟接种２ｍＬꎬ接种载体后１４ｄ各处理均用金刚砂摩擦接种ＣＭＶ病毒ꎮ１.４㊀测定指标１.４.１㊀ＶＩＧＳ载体接种效果及基因沉默效果的测定㊀在接种ＶＩＧＳ载体后１０ｄꎬ各处理随机选择两株烟ꎬ取新长出的叶片ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ按照表１中ＴＲＶ２扩增引物进行ＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ在接种病毒后７㊁１４㊁２１ｄ时ꎬ各处理分别选择３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ反转录成ｃＤＮＡꎬ以烟草２６ＳｒＲＮＡ为内参基因ꎬ根据ＧｅｎＢａｎｋ发布的相关基因序列设计扩增引物(表２)ꎮ按照ＱｕａｎｔｑＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ(ＳＹＢＲＧｒｅｅｎꎬＴＩＡＮＧＥＮ公司)使用说明在ＳｔｅｐＯｎｅＴＭＲｅ￣ａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ仪(Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司)上进行ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ根据已得到的Ｃｔ值ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法分析ＣＭＶ和ＴＲＶ基因的相对表达量ꎮ基因沉默效率(％)计算公式:(对照组ＣＭＶ累积量－处理组ＣＭＶ累积量)/对照组ＣＭＶ累积量ˑ１００ꎮ㊀㊀表２㊀ｑＲＴ－ＰＣＲ所用引物引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)ＣＭＶ－ＦＡＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＣＭＶ－ＲＧＡＡＴＧＣＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＲＶ－ＦＴＧＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＲＶ－ＲＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡ２６ＳｒＲＮＡ－ＦＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＣ２６ＳｒＲＮＡ－ＲＴＣＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧ１.４.２㊀病毒浓度的测定㊀在接种病毒后３０ｄꎬ各处理选择发病情况一致的３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ液氮速冻后保存于冰箱ꎬ使用黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定烟株内ＣＭＶ病毒浓度ꎮ１.４.３㊀发病情况的测定㊀在接种病毒后第７天观察发病情况ꎮ根据«烟草病虫害分级及调查方法»(ＧＢ/Ｔ２３２２２ ２００８)以株为单位进行病级鉴定ꎬ根据下列公式计算发病率㊁病情指数和防治效果ꎮ发病率(％)＝发病株数/调查总株数ˑ１００㊀ꎻ８３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀病情指数＝(Σ各级病株数ˑ病级代表值)/(调查总株数ˑ最高病级代表值)ˑ１００㊀ꎻ防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数ˑ１００㊀ꎮ１.５㊀数据分析采用ＳＰＳＳ１６.０软件对数据进行差异显著性分析(Ｄｕｎｃａｎᶄｓ)ꎬ采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００７整理分析数据ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＶＩＧＳ载体构建由图１可知ꎬＰＣＲ扩增得到的基因片段大小与表１一致ꎮ分别将这些基因片段同ｐＴＲＶ２的线性化载体相连接ꎬ获得对应的表达载体ꎬ将测序正确的表达载体转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮＡ:ＣＭＶ－１ａ的扩增产物ꎻＢ:ＣＭＶ－２ａ的扩增产物ꎻＣ:ＣＭＶ－ＭＰ的扩增产物ꎻＤ:ＣＭＶ－ＣＰ的扩增产物ꎻＭ:２０００＋ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~６:ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀目的基因的ＰＣＲ扩增２.２㊀ＶＩＧＳ载体接种效果以ＴＲＶ２－Ｆ/ＴＲＶ２－Ｒ为引物ꎬ进行ＲＴ－ＰＣＲ检测(图２)ꎬ产物大小约为７４４ｂｐꎬ说明ＶＩＧＳ载体成功导入烟株ꎮＭ为ＤＬ２０００ＭａｒｋｅｒꎻＣ１:接种ＣＭＶ－１ａ载体ꎻＣ２:接种ＣＭＶ－２ａ载体ꎻＣ３:接种ＣＭＶ－ＭＰ载体ꎻＣ４:接种ＣＭＶ－ＣＰ载体ꎮ图２㊀ＶＩＧＳ载体接种烟株后的ＲＴ－ＰＣＲ检测２.３㊀基因沉默效果分析从图３可以看出ꎬ空载体处理的ＣＭＶ相对表达量在接种病毒后７ｄ和２１ｄ与对照相比有一定程度的降低ꎮ接种病毒７ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒１４ｄ后ꎬ空载体处理的病毒相对表达量较对照有一定程度的升高ꎬＣ２和Ｃ３处理的病毒相对表达量均显著低于对照ꎬ基因沉默效率分别为３９.３８％和２６.２４％ꎻ接种病毒２１ｄ后ꎬ接种载体的处理ＣＭＶ相对表达量均显著低于对照和空载体处理ꎬＣ２处理基因沉默效率仍最高ꎬ为３６.８％ꎬＣ４处理次之ꎮ柱上不同小写字母表示不同接种天数不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图３㊀接种病毒后ＣＭＶ相对表达量从图４可以看出ꎬＴＲＶ相对表达量不同处理间差异显著ꎬＣ２处理的ＴＲＶ表达量显著高于空９３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病载体处理ꎬＣ４次之ꎬＣ１最少ꎮ２.４㊀基因沉默后病毒浓度接种病毒３０ｄ后ꎬ各处理ＣＭＶ浓度表现出与ＣＭＶ相对表达量相似的变化趋势ꎬＣ２㊁Ｃ３㊁Ｃ４处理的ＣＭＶ浓度均显著低于对照和空载体处理ꎮ其中Ｃ２处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎻＣ４次之ꎬ病毒浓度为对照的８６.５％ꎻＣ３处理为对照的９１.３％(图５)ꎮ柱上不同小写字母表示不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下同ꎮ图４㊀接种病毒后ＴＲＶ相对表达量图５㊀接种病毒后３０ｄＣＭＶ浓度变化２.５㊀基因沉默后抗病效果分析由表３可知ꎬ发病初期Ｃ２处理的发病率㊁病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎻＣ４处理次之ꎻ空载体的发病情况略轻于对照ꎮ发病高峰期ꎬ除Ｃ２处理发病率为９５％外ꎬ其它处理的发病率均为１００％ꎬＣ２的病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ㊀㊀表３㊀不同处理的发病情况处理发病初期发病率(％)病情指数防治效果(％)发病高峰期发病率(％)病情指数防治效果(％)ＣＫ１００.０６３.３１００.０７２.０空载体８５.７５０.８１００.０６６.０Ｃ１８４.２３８.６３９.１１００.０６２.０１３.９Ｃ２４０.０１６.７７３.７９５.０４１.０４３.１Ｃ３８５.０４５.０２８.９１００.０５６.０２２.２Ｃ４６５.０２８.３５５.３１００.０４８.０３３.３３㊀讨论Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等[２４]将马铃薯Ｙ病毒蛋白酶基因片段转入烟草中ꎬ获得抗马铃薯Ｙ病毒的转基因烟草ꎮ程英豪等[２５]将黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)外壳蛋白转入烟草ꎬ获得的转基因烟草对ＣＭＶ抗性增强ꎮ目前烟草的大多数抗病毒研究都是通过将病毒的外壳蛋白基因导入烟草来提高抗性[２６ꎬ２７]ꎬ该过程会产生病毒蛋白ꎬ因此其安全性存在争议[２８]ꎮ病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)属于转录后水平的基因沉默(ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇꎬＰＴＧＳ)ꎬ利用植物固有的ＲＮＡ干扰和病毒免疫应答机制[２９]ꎬ避免了翻译为蛋白的安全性问题ꎮ目前ＶＩＧＳ技术已成功应用到病虫害防治中ꎬ也被称为寄主诱导的基因沉默(ｈｏｓｔ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＨＩＧＳ)ꎮＮｏｗａｒａ等[３０]首次发现ꎬ将病原体基因导入病毒载体并感染寄主植物后ꎬ寄主植物细胞中会产生ｄｓＲＮＡꎬ并在病原体感染寄主时进入病原体中ꎬ从而引发病原体发生ＰＴＧＳꎮ前人将线虫基因片段导入ＴＲＶ载体后侵染拟南芥ꎬ成功抑制了根部寄生线虫体内目标基因的表达[３１]ꎮ基因沉默的关键是找到起关键作用的靶标基因ꎮＣＭＶ的１ａ和２ａ蛋白共同组成ＲＮＡ聚合酶ꎬ并与寄主因子结合形成复合物ꎬ在病毒的复制中起作用[３２]ꎮ位于胞间连丝的胞间运动蛋白(ＭＰ)参与了ＣＭＶ的胞间运转和系统运转[３３]ꎮ外壳蛋白(ＣＰ)是一个多功能蛋白ꎬ其主要功能是组装病毒ꎬ此外该蛋白还是关键的致病因子ꎬ参与复制㊁翻译㊁运动㊁蚜传等多个过程[３４]ꎮ由于ＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因不同ꎬ因此本研究分别在ＣＭＶ的４个关键蛋白上构建ＶＩＧＳ载体ꎮ本研究建立的ＶＩＧＳ体系中ＣＭＶ－２ａ(Ｃ２)的基因沉默效果最好ꎬ接种病毒后７ｄ基因沉默效率最高ꎬ病毒累积量最低ꎮ这与前人的研究结果相似:将ＣＭＶ的２ａ基因转化入烟草ꎬ获得的烟草植株发病率降低ꎬ发病时间推迟[３５]ꎮ此外ꎬ空载体处理的ＣＭＶ累积量与对照相比也有所下降ꎬ接种病毒后２１ｄ达到显著性差异ꎮ前人研究认为病毒是植物的应激因素ꎬ推测接种空载体后引起０４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀了植物一系列的防御反应[３６]ꎬ抑制了ＣＭＶ病毒在烟株内的传播ꎮ接种病毒３０ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ病毒浓度最低ꎬ即ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的抑制作用最好ꎬ且ＴＲＶ载体的含量在各处理中最高ꎮＣ２处理发病初期的发病率最低ꎬ仅为对照的４０％ꎬ发病时间推迟ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎮ通过ＶＩＧＳ技术沉默ＣＭＶ－２ａ基因可以很好地防治烟草黄瓜花叶病ꎬ下一步将进行大规模田间试验ꎬ为后期大田应用提供理论基础ꎮＶＩＧＳ技术具有成本低㊁方法操作简单等优点[３７]ꎬ并且对植物无伤害ꎬ对环境无污染ꎬ是一种具有较好应用前景的方法ꎮ然而温度是限制ＶＩＧＳ技术应用的主要因素[３８]ꎬ因此开发出耐高温的载体是ＶＩＧＳ技术未来需要努力的重点和方向ꎮ４㊀结论本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因的表达ꎬ基因沉默效率高达４６.２５％ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ发病时间推迟ꎬ防治效果最好ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张俊.我国不同生态区烟草病毒病的分布与检测技术研究[Ｄ].荆州:长江大学ꎬ２０１８.[２]㊀李正风ꎬ刘勇ꎬ夏玉珍.黄瓜花叶病毒及抗病转基因烟草研究进展[Ｊ].生物技术ꎬ２００６(５):８０－８２. [３]㊀乔文婕ꎬ雷荣ꎬ蒋弘山ꎬ等.离子对高效液相色谱法分析黄瓜花叶病毒侵染烟草的总ＲＮＡ水平变化[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１３(４):９０－９５.[４]㊀金大伟.我国主要烟区烟草黄瓜花叶病毒的鉴定及全基因组序列分析[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２０１４. [５]㊀夏烨.三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２０１７.[６]㊀姚敏ꎬ张天奇ꎬ田志超ꎬ等.农杆菌介导的ＣＭＶ侵染性克隆及２ｂ缺失突变体构建[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１１ꎬ４４(１４):３０６０－３０６８.[７]㊀郭依.双链ＲＮＡ介导的烟草抗病毒病(ＴＭＶꎬＣＭＶꎬＰＶＹ)和靶斑病(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ)的研究[Ｄ].沈阳:沈阳农业大学ꎬ２０２０.[８]㊀张璐.黄瓜花叶病毒外壳蛋白与番茄光合作用相关蛋白的互作研究[Ｄ].南宁:广西大学ꎬ２０１７.[９]㊀王兴兴.辣椒抗ＣＭＶ相关ＱＴＬ定位[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０１６.[１０]潘旭浩ꎬ程立锐ꎬ陈小翠ꎬ等.基于ＳＬＡＦ－ｓｅｑ技术的烟草抗ＣＭＶ主效ＱＴＬ定位[Ｊ].中国烟草科学ꎬ２０１８ꎬ３９(５):１－８.[１１]范静苑ꎬ王元英ꎬ蒋彩虹ꎬ等.烟草ＣＭＶ抗性鉴定及抗性基因的ＳＳＲ标记研究[Ｊ].分子植物育种ꎬ２００９ꎬ７(２):３５５－３５９.[１２]程亚增.ＣＭＶ侵染烟草的细胞学观察及表达谱分析[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０１６.[１３]迟孟山.酵母拮抗菌形态转变对逆境耐受性和生防效力的影响研究[Ｄ].合肥:合肥工业大学ꎬ２０１７.[１４]ＲｕｉｚＭＴꎬＶｏｉｎｎｅｔＯꎬＢａｕｌｃｏｍｂｅＤＣ.Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅ￣ｎａｎｃｅｏｆｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９８ꎬ１０(６):９３７－９４６.[１５]ＲａｔｃｌｉｆＦꎬＭａｒｔｉｎ￣ＨｅｒｎａｎｄｅｚＭꎬＢａｕｌｃｏｍｂｅＤＣꎬｅｔａｌ.Ｔｏｂａｃ￣ｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓａｓａｖｅｃｔｏｒｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２５(２):２３７－２４５.[１６]ＢａｕｌｃｏｍｂｅＤ.ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００４ꎬ４３１(７００６):３５６－３６３.[１７]ＰａｎｇＪＨꎬＺｈｕＹꎬＬｉＱꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａ￣ｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｉｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１７ꎬ８(９):ｅ７３２１１.[１８]李杰ꎬ罗江宏ꎬ万子龙ꎬ等.ＶＩＧＳ技术在辣椒基因功能研究中的应用进展[Ｊ].河南农业科学ꎬ２０２１ꎬ５０(６):９－１５. [１９]ＣｈａｎｄａｎＲＫꎬＳｉｎｇｈＡＫꎬＰａｔｅｌＳꎬｅｔａｌ.ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｔｏｍａｔｏＣＴＲ１ｐｒｏｖｉｄｅｓｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｔｏｍａｔｏｌｅａｆｃｕｒｌｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１９ꎬ１４(３):ｅ１５６５５９５.[２０]ＺｈｏｕＸＨꎬＬｉｕＪꎬＢａｏＳＹꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｗｉｌｄｅｇｇｐｌａｎｔＳｏｌａｎｕｍａｃｕｌｅａｔｉｓｓｉｍｕｍＮＢＳ－ＬＲＲｇｅｎｅꎬｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉ￣ｔａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ１９(２):５８３.[２１]龚攀.甜菜病毒诱导基因沉默体系建立及抗旱基因功能验证[Ｄ].哈尔滨:哈尔滨工业大学ꎬ２０１５.[２２]刘天波ꎬ蔡海林ꎬ滕凯ꎬ等.病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Ｙ病毒病研究[Ｊ].中国烟草学报ꎬ２０２０ꎬ２６(５):８２－８９.[２３]魏颖颖ꎬ王凤龙ꎬ钱玉梅.植物与黄瓜花叶病毒互作的研究[Ｊ].植物保护ꎬ２００５(１):１５－１８.[２４]ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭꎬＧｒａｈａｍＭＷꎬＷａｎｇＭＢ.ＶｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓｃａｎｂｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｅｎｓｅａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ１９９８ꎬ９５(２３):１３９５９－１３９６４.[２５]程英豪ꎬ吴光ꎬ王继伟ꎬ等.表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的１４１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染[Ｊ].植物学报ꎬ１９９７ꎬ３９(１):１６－２１.[２６]ＦｕｃｈｓＭꎬＭｃＦｅｒｓｏｎＪＲꎬＴｒｉｃｏｌｉＤＭꎬｅｔａｌ.ＣａｎｔａｌｏｕｐｅｌｉｎｅＣＺＷ￣３０ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬｚｕｃｃｈｉｎｉｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬａｎｄｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓ￣２ｉｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｒｅｅｄ.ꎬ１９９７ꎬ３(４):２７９－２９０.[２７]牛颜冰ꎬ王德富ꎬ姚敏ꎬ等.应用ＲＮＡ沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)和烟草花叶病毒(ＴＭＶ)转基因烟草[Ｊ].作物学报ꎬ２０１１ꎬ３７(３):４８４－４８８.[２８]颜培强ꎬ李丽杰ꎬ康宏ꎬ等.应用ＲＮＡｉ技术培育抗２种病毒病的转基因烟草[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００７(１１):２７－３１.[２９]郝梦媛ꎬ杭琦ꎬ师恭曜.ＶＩＧＳ基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[Ｊ].中国农业科技导报ꎬ２０２２ꎬ２４(１):１－１３.[３０]ＮｏｗａｒａＤꎬＧａｙＡꎬＬａｃｏｍｍｅＣꎬｅｔａｌ.ＨＩＧＳ:ｈｏｓｔ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｔｈｅｏｂｌｉｇａｔｅｂｉｏｔｒｏｐｈｉｃｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎＢｌｕｍｅ￣ｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１０ꎬ２２(９):３１３０－３１４１. [３１]ＶａｌｅｎｔｉｎｅＴＡꎬＲａｎｄａｌｌＥꎬＷｙｐｉｊｅｗｓｋｉＫꎬｅｔａｌ.Ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔｏｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｕｓｉｎｇａｔｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００７ꎬ５(６):８２７－８３４.[３２]田桂英ꎬ乔亚红ꎬ向本春ꎬ等.双抗ＣＭＶ和ＴｏＭＶＲＮＡｉ载体的构建及烟草遗传转化[Ｊ].石河子大学学报(自然科学版)ꎬ２０１２ꎬ３０(６):６８９－６９４.[３３]蒙姣荣ꎬ彭好文.植物病毒系统运转研究进展[Ｊ].安徽农业科学ꎬ２００６ꎬ３４(１３):２９６３－２９６５.[３４]于海龙ꎬ张正海ꎬ曹亚从ꎬ等.辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展[Ｊ].园艺学报ꎬ２０１９ꎬ４６(９):１８１３－１８２４. [３５]ＷｉｎｔｅｒｍａｎｔｅｌＷＭꎬＺａｉｔｌｉｎＭ.Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｒｅａ￣ｓｅｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｒｅｐｌｉｃａｓｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ８１(Ｐｔ３):５８７－５９５.[３６]ＴｒｅｔｉａｋｏｖａＰꎬＶｏｅｇｅｌｅＲＴꎬＳｏｌｏｖｉｅｖＡꎬｅｔａｌ.Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｏｆｔｈｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅＴＲＩ５ｉｎＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏ￣ｒｕｍａｎｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｕｃｅｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎＶＩＧＳａｎｄＳＩＧＳｅｘ￣ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２２ꎬ１３(３):３９５.[３７]魏正欣ꎬ孙虎ꎬ向艳涛ꎬ等.病毒诱导基因沉默技术在豆科植物中的应用[Ｊ].中国油料作物学报ꎬ２０２２ꎬ４４(３):４９７－５０２.[３８]张新华ꎬ季娜娜ꎬ闵德栋ꎬ等.ＶＩＧＳ载体在果树中的应用研究进展[Ｊ].果树学报ꎬ２０１７ꎬ３４(４):５０７－５１４.２４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。
2021年34卷5期Vol.34No.5!"农业学&Southwest China Journal of Agricultural Sciences1073文章编号：1001-4829(2021)5-1073-07DOI：10.16213/j.enki.sejas.2021.5.024辣椒品种（组合）抗病性水平差异测定裴卫华1,施竹凤打王会2,毕云青打张庆1,杨佩文1,吴贵宏J杨明英1（1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南昆明650205；2-丘北县温浏乡农业综合服务中心，云南丘北663208；3-瑞丽海关综合技术中心，云南瑞丽678600）摘要：！目的】通过对不同辣椒品种（组合）进行种植及抗病性鉴定试验，筛选出具有抗病水平的辣椒品种（组合）。
［方法】根据疫病、白粉病、炭疽病和病毒病的病害特点和病原菌特性，结合1种和W蘊发病综合分析，评价辣椒品种组合材料的抗性水平。
［结果】15个辣椒＞种（组合）抗感性水平表现有较大差异，辣椒＞种（组合）红泰664、红泰668、渝椒13号、组合1-1和5-1等对疫病、白粉病、炭疽病和病毒病综合抗病性较强；其次是艳椒435、艳椒465、渝椒15号、组合3A、4-1、6A和7-1等综合抗病性中上水平;组合2-1综合抗病性水平一般;感病品种小米辣和朝天椒均表现感病，抗病品种云干椒7号表现抗病。
【结'】综合抗病性在中抗以上的辣椒品种可在辣椒生产中轮换种植,抗病以上的辣椒组合可在育种中资源利用，为抗病辣椒品种的选育及推广提供理'依据$关键词：辣椒;疫病；白粉病；炭疽病；病毒病；抗病性中图分类号:S641.3文献标识码：ADifference of Disease Resistance Level of Peeper Varieties(Combinations)PEI WeiAuv1%SHI ZhuAeng1,WANG Hui2%BI Yun-qing1%ZHANG Qing1%YANG Pedaen1%WU Gui-hong3%YANG Ming-ying1*(1.Ag/cultural Environment and Resources Institute,Yunnan Academy of Ag/cultural Sciences,Yunnan Kunming650205,China； 2.Wenliu Comprehensive Agricultural Service Center of Qiubei County,Yunnan Qiubei663208,China；3-Rudi Customs Comprehensive TechnoaogyCentee,Yunnan Ru a678600,Ch1na)Abstract：【Objective]DiOerent Pepper vv/eties(combinaSons)with disease resistance were screened through field planting and disease resistance identification-【Method]According to the disease chaccteCsOcs and pathogen characteristics of phytophthora blight,powdeg mildew,anthracnose and vics disease,combined with the comprehensive analysis of inoculation and natural occurrence,tie resistance level of pepper varieties(combinations)was evaluated-【Result]The results showed that the csisOnces of15pepper vv/eties(combinations)were signidcantly diOecnt,and the pepper varieties(combinations)Hongtai664,Hongtai668,Yujiao13,and combinations1-1and5-1had steongeecompeehensieeeesistancetoPhytophthoeacapsici,Powdeeymiadew,Peppeeantheacnoseand eieusdisease.Then,thecompeehen-sive disease resistance levels of Yanjiao435,YanjiaO65,Yujiao15,combination3-1,4-1,6-1and7-1were in the mibdle and upper level-The comprehensive disease resistance level of combination2-1was general.The susceptible cultivars millet pepper and Chaotan pepper were susceptible,and the resistant vasety Yungan Pepper No.7showed disease resistance-【Conclusion]Varieties with moderate resistance or above could be used in rotation cultivation-Varieties with general resistance cout be used as resources in breeding.The results provideda theoretical basis Or the breeding and application of resistant varieties-Key wordt：Peppee；Phytophthoeacapsici；Powdeeymiadew；Peppeeantheacnose；Vieusdisease；Diseaseeesistance【研究意义］通过对不同辣椒品种（组合）进行种植及抗病性鉴定试验，筛选出具有抗病水平的辣收稿日期：2020-04-28基金项目：云南省重大科技专项（2019ZG001）；云南省重大科技专项（202002AE320005）作者简介:裴卫华（1982-）,男，助理研究员，在读博士，山西平遥人,主要研究方向为植物病理学研究，E-mail：117654899@ ；*为通讯作者,杨明英,E-mail：455836785E 。
辣椒病毒病防治方法:辣椒病毒病用什么药
效果好
辣椒病毒病用什么药效果好呢？辣椒病毒病各地发生普遍，是保护地辣椒生产中的重要病害。
下面我们讲一讲辣椒病毒病防治方法，供参考。
一、辣椒病毒病用什么药
目前市场上防治病毒病的药剂有植病灵、32%核苷。
溴。
吗啉胍(全新配方)、抗病威（病毒k）、病毒立克、病毒a、病毒b、病毒杀星等。
病情严重时，应多种药物混合使用：选用20%病毒a可湿性粉剂500倍液，或病毒k300～400倍液，或1.5%植病灵乳油1000倍液，或ns-83增抗剂100倍液，或铜氨合剂400倍与0.1%硫酸锌混匀喷雾防治，隔7～10天喷1次，连喷2～3次。
二、辣椒病毒病症状
辣椒病毒病症状十分复杂，有多种表现类型，最主要的有两种类型：
黄斑花叶型：病株矮化，茎和枝条上有褐色坏死条斑。
叶片呈深绿、浅绿或黄绿镶嵌的斑驳花叶，叶脉上有时有褐色坏死斑点。
黄化枯斑型：病株矮化，叶片褪绿或黄绿，病株顶叶变小、狭长，中下部叶片上常生有坏死斑块(褪绿变黄的斑块)，有时病斑部开裂，病叶极易脱落。
后期腋芽抽生呈丛簇状态，叶片蕨叶状。
三、辣椒病毒病的病原
病毒病的病原种类较多，黄斑花叶型病原主要为烟草花叶病毒，黄化枯斑型病原主要为黄瓜花叶病毒。
高温干旱，重茬，肥水不足植株长势弱容易发病。
蚜虫多，防治不及时发病重，光照过强也容易发病。
四、辣椒病毒病的预防方法
1、选用抗病、耐病品种，最好用无病(不带病毒)种子。
培育适龄壮苗。
避免重茬和迎茬，与非茄科作物进行2年以上轮作。
2、定植后加强管理，促进缓苗快，发棵早，植株生长健壮，提高抗病力。
126--农业经济•专题综述 DOI:10.16498/ki.hnnykx.2016.010.035自首次报道转基因植物表达植物病毒序列并表现抗病性以来，人们尝试了各种不同类型的抗性产生方法。
这些方法主要包括表达不同的病毒序列、非病毒序列、宿主来源的抗性基因及各种宿主防御反应因子等。
笔者主要围绕以上各种成分或序列介导产生的抗性展开综述。
1 病毒蛋白介导的抗性策略1.1 外壳蛋白介导的抗性外壳蛋白（Coat protein ，CP ）介导的抗性方法主要通过在转基因植株表达病毒的外壳蛋白基因从而获得抗此种病毒或相关病毒的能力。
1986年Abel 等[1]将烟草花叶病毒（TMV ）的外壳蛋白编码序列导入到烟草中，获得了具有TMV 抗性的抗病毒植株。
随后，科学家们先后将黄瓜花叶病毒（CMV ）、马铃薯Y 属病毒（PVY ）、辣椒重症花叶病毒（PepSMV ）等的外壳蛋白基因导入烟草植株后，均得到了抗病毒植株。
外壳蛋白介导的抗性可能是蛋白质水平介导的干扰或RNA 水平的沉默的结果，也可能同时存在蛋白质和RNA 两种作用机制。
此外，当接种高病毒剂量或接种病毒RNA 时，外壳蛋白介导的抗性普遍存在容易被打破的共性[2-4]。
1.2 复制酶基因介导的抗性复制酶（Replicase ）介导的抗性方法主要通过表达病毒复制酶通读序列、全长序列、突变序列及缺失序列获得具有抗病毒能力的植株。
1990年Golemboski 等[5]将TMV 的54KD 复制酶基因转入烟草植株，获得了高抗TMV 的转基因抗病毒植株。
研究表明，复制酶基因介导的抗性策略产生的抗性不具广谱性，接种非常高剂量的病毒时表现出强抗性，接种病毒RNA 时也表现出高水平的抗性[6]，但是表达缺失型复制酶蛋白编码序列表现出广谱抗性[7]。
关于复制酶基因介导的抗性机制尚无定论。
多数早期的研究认为复制酶基因介导的抗性是由蛋白介导的，稍后的研究却发现存在RNA 介导的过程，也许复制酶基因介导的抗性在蛋白质水平和RNA 水平存在互补或替换的过程[6]。
基因编辑技术在蔬菜中的研究进展一、本文概述随着现代生物技术的迅猛发展，基因编辑技术已经成为现代农业科学研究领域的一个重要突破。
特别是在蔬菜领域，基因编辑技术展示了巨大的潜力和广阔的应用前景。
本文旨在全面概述基因编辑技术在蔬菜研究中的应用现状、最新进展以及面临的挑战。
我们将深入探讨基因编辑技术在蔬菜品质改良、抗病性增强、产量提升以及环境适应性改善等方面的应用，并展望其未来的发展趋势。
通过本文的阐述，我们期望能够为读者提供一个清晰、全面的视角，以理解基因编辑技术在蔬菜科学研究中的重要作用及其潜在影响。
二、基因编辑技术的基本原理与方法基因编辑技术是一种在分子水平上对生物体的基因进行精确修饰和调控的新兴生物技术。
它通过直接对目标基因进行定点切割，引发细胞的修复机制，进而实现基因的敲除、插入、替换或修饰，从而达到改变生物遗传性状的目的。
这一技术的发展，对于蔬菜遗传育种工作产生了革命性的影响，极大地提高了育种的效率和精度。
目前，应用最广泛的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统。
该系统来源于古细菌的适应性免疫防御机制，通过人工改造，可以精确识别并切割目标DNA序列。
CRISPR-Cas9系统主要由两部分组成：一是CRISPR-RNA（crRNA）和反式激活CRISPR-RNA（tracrRNA），它们共同形成RNA复合物，负责识别并引导Cas9蛋白到目标DNA序列；二是Cas9蛋白，它是一种核酸内切酶，可以在识别到目标序列后，对其进行切割，造成DNA双链断裂（DSB）。
DSB会触发细胞内的DNA修复机制，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种修复方式。
NHEJ修复过程中，由于缺少同源模板，往往会在断裂处随机插入或删除一些碱基，导致目标基因的功能丧失，从而实现基因敲除。
而HDR修复则需要一段与目标基因同源的DNA模板，细胞可以按照这个模板进行精确修复，从而实现基因的精确替换或插入。
基因编辑技术的另一个重要方法是锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）。
辣椒抗黄瓜花叶病毒育种研究进展作者：付楠王平勇魏萌涵解慧芳刘金荣来源：《中国瓜菜》2018年第07期摘要：黄瓜花叶病毒（CMV）是一种严重危害辣椒生产的病毒，抗黄瓜花叶病毒育种是辣椒育种的主攻目标之一。
经过多年攻关，我国筛选鉴定出一批抗病种质资源，但仍存在抗源材料遗传背景狭窄、抗性不高、转育难等问题。
随着现代分子技术的快速发展，利用分子标记、基因组学、生物信息学、基因工程等手段，可以加深对抗性遗传规律的认识，结合分子标记辅助选择的方法，提高育种效率。
从辣椒上黄瓜花叶病毒的株系划分、种质资源的筛选鉴定、抗病遗传规律和基因定位研究、抗病品种选育、病害防治方面介绍了辣椒抗黄瓜花叶病毒的研究进展，以期为深入研究辣椒抗CMV和抗病育种提供参考。
关键词：辣椒；黄瓜花叶病毒（CMV）；种质资源；抗病育种；病害防治Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） seriously affects pepper production.The improvement of pepper resistance to CMV is one of the main breeding targets.After many years of efforts， a number of disease-resistant germplasm resources have been screened and identified. However， there are still some problems such as narrow genetic background， low resistance and the loss of resistance in the course of breeding. With the rapid development of modern molecular techniques， the use of molecular markers， genomics， bioinformatics and genetic engineering means， can deepen the understanding of the genetic law of disease resistance. The efficiency of breeding can be improved in combination of marker-assisted selection methods. This paper reviews on the research progress of resistance to CMV in pepper ragarding classification of CMV strains，screening of germplasm，genetic analysis and gene mapping，breeding of CMV-resistant varieties and disease control methods，in order to provide some reference for in-depth study of resistance to CMV and disease-resistant breeding.Key words： Capsicum；Cucumber mosaic virus （CMV）；Germplasm；Disease-resistant breeding；Disease control黃瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus），寄主范围极其广泛，能侵染1 000多种单、双子叶植物。
可经蚜虫、种子传播，给许多作物造成严重危害，如引起番茄的坏死、香蕉的花叶（心腐）、豆科植物的花叶、瓜类的花叶、西番莲的死顶等[1]。
辣椒（Capsicum spp.）属于茄科（Solanaceae）辣椒属一年或多年生草本植物，营养价值高，维生素C含量居蔬菜之首，且食用方法多样，是我国重要的蔬菜作物之一，年种植面积100多万hm2。
随着辣椒栽培面积的不断扩大，病毒病成为制约辣椒产量的重要因素，其中CMV在我国辣椒生产中检出率最高，且危害严重，是我国辣椒病毒病的主要毒源之一。
CMV 侵染后，辣椒产生花叶、蕨叶、环斑、条斑或全株矮化、果实畸形等症状。
一般年份造成辣椒减产20%～30%，流行年份甚至造成辣椒绝收。
目前，病毒病的防治常采用传统的药剂防治法，但长期使用农药不仅影响辣椒的产量和品质，而且污染环境，破坏生态平衡。
因此，抗黄瓜花叶病毒育种一直是辣椒育种的主攻目标之一。
传统抗病育种方法耗时长，品种更替远远落后于病毒株系的变异，随着现代分子技术的快速发展，了解抗病基因的遗传规律、发掘抗病基因、利用分子辅助选择和基因工程等手段选育抗性材料是解决辣椒CMV抗病育种最根本的途径。
1 黄瓜花叶病毒1.1 CMV的核酸组成CMV为三分体病毒，由RNA 1、RNA 2、RNA 3 3个基因组和RNA 4亚基因组片段构成，常存在卫星RNA分子[2]。
RNA 1与RNA 2含有复制酶基因，分别编码111 KD和97 KD 蛋白质，决定着侵染寄主植物的症状表现、种传以及对温度的敏感性[3]。
RNA 3通过RNA 4翻译表达外壳蛋白（Coat Protein，CP）的遗传密码，从而决定了CMV蚜传、电泳和血清学等性质，RNA 3编码的运动蛋白（Movement Protein，MP）还与病毒在寄主细胞间的运动有关[4-5]。
卫星RNA是依赖病毒复制的小分子RNA，其在不同株系间高度同源但与基因组RNA 无同源性，卫星RNA很难从CMV中除去，大多数寄主上卫星RNA能减轻CMV症状[6]。
1.2 CMV的株系划分一种病原物常常分化出若干种致病力不同的生理小种或株系，株系的鉴定和划分对抗病毒病育种和病害防控具有重要意义。
国外根据寄主症状、血清学关系和核苷酸序列同源性把CMV株系划分成S和WT类群[7]。
我国主要是以寄主症状和鉴别寄主反应来确定CMV株系，由于不同学者采用的鉴别寄主和测定条件不同，目前株系的划分并不统一。
田如燕等[8]将北京地区辣椒CMV划分为重花叶株系、坏死株系、轻花叶株系和带状株系。
杨秀荣等[9]选用6个有代表性的辣椒品种组成寄主鉴定谱，将北疆地区辣椒6个CMV分离物划分为坏死落叶型、花叶型和轻花叶型。
为了能反映出病原病毒与品种抗性间的“基因对基因”关系，适于抗病育种的需要，提出了基因型株系的概念。
杨永林等[10-11]筛选出5个对CMV抗性有明显差别的辣椒品种组成基因型株系鉴别寄主谱，将代表全国6个省市的20个主要CMV分离物划分为6个致病型明显不同的株系群，并将吉林省的59个辣椒CMV分离物划分为CMV-P0、CMV-Pl、CMV-P2、CMV-P3、CMV-P4株系；同时筛选出一套“致病型”株系鉴别寄主谱将吉林省的59个辣椒CMV分离物划分为十字花科株系群，藜科株系群，茄科、葫芦科株系群，豆科株系群，普通黄色花叶株系群。
也有研究根据抗原特性认为四川烟区的CMV株系主要属于ⅠB亚组。
Yu等[12]对我国不同地区不同年份采集的130多份CMV阳性样品和核酸系列相似性，将其分为2个亚组（亚组Ⅰ和亚组Ⅱ），其中亚组Ⅰ进一步分为ⅠA 和ⅠB[13]。
赵雪君等[14]依据病毒的CP基因序列合成引物，利用 RT-PCR技术进行检测和鉴定，测定结果表明，亚组Ⅰ占93.1%以上，亚组Ⅱ占6.9%。
2 辣椒抗CMV的种质资源筛选种质资源是遗传育种的基础，我国不断加强辣椒抗CMV资源的引进和鉴定工作，筛选鉴定出一批抗病耐病的种质资源。
刘建华[15]从来自全国除台湾和西藏以外的29个省市收集的1 322份辣椒资源中筛选到高度抗CMV材料29份。
王述彬等[16]從154份国内辣椒种质资源中鉴定出11份抗CMV材料。
毛爱军等[17]从63份辣椒高代自交系中筛选到45份抗CMV材料。
黄启中等[18]从280份辣椒种质资源中鉴定获得3份抗TMV或抗CMV的材料。
林清等[19]从223份辣椒材料中筛选到27 份中抗CMV的材料。
张晓敏等[20]从363 份供试材料中筛选出抗病材料2 份、中抗材料124 份。
李宁等[21-22]从国外引进的53 份辣椒种质中筛选出中抗CMV的材料6 份，之后又从283 份辣椒种质中筛选出抗CMV辣椒种质1 份、中抗28 份。
这些抗病材料对辣椒优质种质研究具有重要价值，为培育抗病品种打下基础，但是所获得的抗病材料，免疫和高抗资源较少，兼抗几种病的资源更少，所以搜集鉴定高抗资源或者通过多基因聚合技术获得高抗和多抗育种材料是一个长期任务。
邹学校[23]的研究表明，品种抗CMV能力与抗寒性呈正相关，起源于低温地区的辣椒品种较抗CMV。
刘建华等[24]研究表明，辣椒对CMV的抗性与辣椒素含量呈正相关，且对CMV的抗病性与对TMV的抗病性具有极显著回归关系。
张晓敏[20]的研究表明，花期较晚和植株较矮的材料中，抗病性强的比率较高，且辣椒 CMV 的抗性也与辣椒种质资源的地理分布有一定的关系。
这些研究结果为抗病材料的筛选鉴定和选育提供了参考。
3 抗病遗传规律的研究由于所用辣椒材料及CMV株系各异，不同的研究所得出的遗传规律也存在差异。
国外研究中，辣椒对CMV的抗性主要有3种结论：单隐性基因控制[25-26]，单显性基因控制[27]，多基因控制[28]。
我国的研究结果相对统一，主要认为辣椒对CMV的抗性是多基因控制的不完全显性遗传。
阎淑珍、于喜燕、姚明华等[29-31]的研究表明，辣椒对CMV的抗性受多基因控制，符合加性-显性模型，且加性更显著。
邹学校等[32]研究表明CMV抗性遗传符合“加性-显性”模型，F1代杂种抗性是纯合的显性基因决定的。
吴小丽[33]发现辣椒苗期和成株期对CMV的抗性都是由两对主基因控制的，但主基因间表现的作用有所不同，有的表现为加性-显性-上位性作用，有的表现为加性-显性作用。
王兴兴[34]构建辣椒F2群体（Carolina Wonder×83-58）和重组自交系群体（83-58×Perennial），通过遗传模型分析表明，F2群体对CMV的抗性符合加性-显性-上位性基因遗传模型，RIL（重组自交系）对CMV的抗性符合加性-显性基因遗传模型，且两个群体的抗性都是由2 个主基因和多个微效基因控制。
4 抗CMV基因定位研究Kang等[27]从Bukang辣椒栽培种中找到了一个单一显性抗病基因命名为Cmr1，并将其定位在2号染色体上。
