肺癌干细胞基因Oct—4表达的临床意义

肺癌干细胞基因Oct—4表达的临床意义作者：张丽丽林育红来源：《中国医药导报》2013年第14期[摘要] 目的研究肺癌干细胞的基因表达与临床特征、病理特征、预后间的关系。

方法应用流式细胞仪分选出肺癌干细胞，并应用RT2 ProfilerTM PCR仪检测肺癌干细胞与非肺癌干细胞间的差异性基因表达。

应用免疫组化分析干细胞基因Octamer-4（Oct-4）的表达与临床病理特征之间的关系。

应用Western-blot检测肺癌干细胞中Oct-4蛋白的表达情况。

结果肺癌干细胞与非肺癌干细胞间显著差异性表达的基因共7种，包括干细胞分化相关因子（CD44、Oct-4和nestin）、细胞周期调节因子（APC和CDC2）以及生长因子（HGF和TGF）。

其中，Oct-4蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P = 0.001）。

经过生存分析，Oct-4蛋白高表达病例的术后无病生存期明显短于Oct-4低表达或无表达的病例（P = 0.001）。

在Cox回归模型中，肿瘤大小、淋巴结转移和Oct-4的表达为独立预后因子（分别为P = 0.031、0.002和0.003）。

结论 Oct-4在肺癌干细胞中高表达，并可作为肺癌发生、进展及分化的潜在生物标志。

[关键词] 肺癌；干细胞；Oct-4；生存期[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（b）-0022-04干细胞在肿瘤细胞中所占比例极少，目前已知它们是某些，并很可能是大部分肿瘤的起源[1-2]。

癌症干细胞假说认为，某些干细胞在组织受损或是疾病后，会不断地予以补充，然而，由于干细胞的自我更新及较长时间的生存能力，成人干细胞同样可能积累突变，这将导致干细胞产生不可控分裂的细胞，由此产生肿瘤[1-2]。

肺癌干细胞是一小群具有自我更新、较强的形成实体肿瘤并可以分化成为相对静止和原始肿瘤细胞能力的肿瘤细胞，被认为是肺癌治疗耐药的主要原因[3-4]。

近来，一些研究显示肿瘤干细胞可能从长期积累基因突变的成人干细胞转化而来[5-6]。

因此，成人干细胞被认为是恶性过程的靶向细胞。

由于癌症干细胞来源于成人干细胞，一些成人干细胞和胚胎干细胞相关基因，尤其是那些在胚胎发育过程中扮演着重要角色的基因亦有可能作用于肿瘤形成。

OCT-4是由POU5F1基因编码产生的、含POU结构域的转录因子家族中的一员。

该蛋白在未分化的胚胎干细胞中精确表达。

在敲除该基因后胚胎干细胞即失去干细胞特性[7]。

在早期胚胎干细胞系研究中，Babaie等人在人类胚胎干细胞中应用功能性基因组的方法，通过RNA干扰而介导对OCT-4功能的抑制，分析了由此引发的转录改变来确认人类细胞中的OCT-4依赖基因。

他们观察到OCT-4的下调对许多参与最早期后置入分化事件的基因有显著作用。

这些发现说明细胞的状态越原始，OCT-4的作用就越重要。

另外，还观察到OCT-4与Nanog协同作用时对小鼠的胚胎干细胞的分化有很强的抑制作用[9]。

最近的研究发现，OCT-4在具有干细胞特征的成人组织细胞中阳性表达，比如基底层细胞、乳腺干细胞和胃干细胞[10]。

目前OCT-4 被发现于胚胎和生殖细胞瘤中表达，例如胚胎性癌、生殖细胞瘤、睾丸原位癌、无性细胞瘤、精原细胞瘤以及含有非精原细胞瘤的胚胎性癌[11-13]。

Oct-4在多能细胞中高度表达，同时在分化后和成熟的细胞中低表达或不表达。

因此，OCT-4在胚胎和生殖细胞瘤中的表达可能参与维持肿瘤细胞的自我更新[14]。

随着对癌症干细胞理论的理解不断深入，恶性肿瘤中的干细胞相关基因得到了更多的学术关注。

目前，有关OCT-4在肺癌干细胞的生物学行为中的功能和特殊机制的研究仍然较少。

并且，肺癌中OCT-4蛋白表达和临床病理特征间的关系仍然不清楚。

在该研究中，笔者应用基因芯片技术来研究干细胞相关基因，以求为肺癌的治疗打下基础。

1 材料与方法1.1 材料选择了2005年1月～2006年12月的126例肺癌患者，对术中切除的标本进行了免疫组化染色及预后分析。

另外，应用PCR基因芯片分析干细胞基因表达情况。

以下抗体购自BD Pharmingen公司（BD CO. USA）：CD24-PE，CD44-FITC，CD2-FITC，CD3-APC，CD10-PE，CD16-FITC，CD18-APC，CD31-PE，CD326-FITC（EpCAM）。

超低粘附盘，无菌细胞刮板， MammoCultr基础培养基，MammoCultr增殖补充，HBSS，氢化可的松以及肝素购自加拿大STEMCELL Technologies公司。

抗Oct-4抗体购自Sigma Aldrich公司。

流式细胞仪购自BD Pharmingen公司（FACSCALIBUR，BD A）。

干细胞RT2 ProfilerTM PCR仪和ABI PRISM7700系统（美国应用生物系统公司）购自SABiosciences公司。

1.2 方法1.2.1 肺癌干细胞成瘤能力的鉴定即将进行注射的人类肺癌干细胞呈悬浮状态，注射至小鼠脂肪层的合适部位。

1.2.2 微球体传代检测将50 mL的MammoCultTM人增殖补充液加入到450 mL的MammoCultTM人基础培养基中以制备完整的MammoCultTM人培养基。

完整的MammoCultr 人培养基中的细胞以每毫升20 000个可繁育的细胞的密度附着于超低附件板上（Corning，Acton，MA，USA）。

于培育7 d后评估球体的数量。

1.2.3 PCR微阵列将各106个CD44+/CD24-肿瘤细胞和非CD44+/CD24-肿瘤细胞反复抽吸溶解。

为了去除溶解的细菌和酵母等，需应用高速搅拌器。

处理RNA的过程分为以下几步：相位分离、沉淀、洗脱、移除对RNA造成污染的DNA。

在应用RT-PCR之前，再次对RNA 的含量及纯度进行评估。

1.2.4 免疫组织化学应用免疫组化的方法检测乳腺组织中Oct-4的表达水平[14]。

固定肺癌组织和癌旁组织，制成4 μm的组织切片。

以二甲苯脱蜡、梯度酒精逐渐水化，再以PBS液冲洗。

应用IgG、抗体，分别以1∶100浓度的鼠抗人Oct-4抗体37℃孵育1 h。

后用PBS液洗涤后，以最佳生物素化的二抗（Multilink Swine anti-goat/mouse/rabbit immunoglobulin； Dako，Carpinteria，USA）在37℃中孵育30 min。

用HRP抗生物素蛋白生物素复合物（以1∶1000的浓度，Vector Laboratories，Burlingame，USA）在室温下30～60 min检测结合生物素基化的抗体。

组织片段的免疫印迹以DAB做显色处理，以吉尔苏木素复染这些片段并观察。

来自于个体组织的3个片段的全部以单抗体著色，依照盲法，每个片段随机选择十个结构域通过病理来检测Oct-4的表达。

根据以下标准来半定量检测Oct-4的表达水平：0代表应用SPSS统计软件13.0进行统计分析。

应用χ2检验、Fisher精确概率、独立t检验来计算肿瘤标志物与其他临床参数间的关系。

应用Kaplan-Meier生存分析计算无病生存期。

应用对数秩检验计算生存差异。

应用Cox回归分析来进行多因素分析。

以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 肺癌干细胞的干细胞性的鉴定2.2 肺癌干细胞与非肺癌干细胞间的基因表达差异检测2.4 Oct-4蛋白表达与预后的关系3 讨论在胚胎形成的早期，Oct-4基因高度表达，并且能够在分化相关基因表达的很多方面起到了调解作用，但是Oct-4的功能随着胚胎的发生过程而受到了抑制[16]。

在未发生分化的时期，Oct-4能够维持胚胎干细胞的功能，因此，Oct-4被认为在调控成体干细胞功能中是一个关键的作用因子[16-17]。

迄今为止，很多的研究都以Oct-4作为一个成体干细胞的标志物来应用[20-21]。

然而，Oct-4在成人已分化细胞中的表达对于之前认为其仅仅是一个干细胞标志物的说法提出了挑战和质疑[18-19，22-24]。

Tai等人报道了Oct-4在人类肺癌上皮细胞，胰腺癌细胞系Capan22和Pan21、肝癌细胞系Mah lava、海拉宫颈癌细胞系及人乳腺癌细胞系MCF-7中都有较高的表达水平[25]。

他们提出一个假说，Oct-4阳性的肿瘤细胞是来源于Oct-4的成体干细胞的。

目前，关于Oct-4蛋白的表达状态，其与肺癌生物学行为之间的关系尚未阐明[26]。

并且，探寻肺癌中干细胞基因的表达情况和干细胞基因的表达与其临床病理学特征及对肺癌的诊断之间的联系的研究仍然较少。

目前的研究中，笔者成功地在肺癌干细胞和非肺癌干细胞中选出了表达水平存在差异的包括CD44、Oct-4、nestin、APC、CDC2、HGF 和 TGF 在内的7个不同的基因。

Oct-4在肺癌干细胞中高度表达，其也许就是一个提示肺癌发生、发展和分化的新的可能的生物学标志。

然而，Oct-4在肺癌干细胞中表达的潜在机制尚不明确。

因此Oct-4基因的表达与肺癌生物学行为之间的关系仍然需要进一步的调查研究。

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