获取基因全长cDNA策略及应用

第29卷第2期2009年4月健康研究HealthResearchVo.l29No.2Apr.2009

收稿日期:2008-12-19作者简介:邵󰀁珏(1983-),女,浙江杭州人,硕士研究生,专业:遗传学。通信作者:曹明富(1955-),男,浙江海宁人,教授,博士生导师,研究领域:细胞生物学与毒理遗传学。获取基因全长cDNA策略及应用

邵󰀁珏,邵玉锁,曹明富(杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036)

摘要:全长cDNA是研究基因功能的关键,获得全长cDNA也是基因组研究的重要内容之一,本文概述了近年来国内外获取未知基因cDNA全长的理论及其应用。关键词:全长cDNA;mRNA;PCR;进展中图分类号:Q73󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1008-4894(2009)02-0140-03󰀁󰀁模式植物结构基因组的相继阐明,多种植物高密度分子标记连锁图谱的构建、大片段DNA克隆系统的建立,序列测定技术和基因遗传转化技术的发展,使得更多未知基因的克隆成为可能,同时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任务。不论功能基因组学多么深奥,其认识基因功能的基本前提是获取可能有相关功能的基因之全长编码序列。其中,全长cDNA序列的获取是正确地注释基因组序列、进行基因的功能及产物分析的必要前提。本文就获取基因全长cDNA策略及应用进行综述。1󰀁图位克隆技术(map󰀁basecloningorpositionalcloning)󰀁󰀁其基本工作思路为:首先将目的基因精确定位在分子标记连锁图上,利用与目的基因紧密连锁的标记筛选大片段DNA文库(如YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文库),并构建含目的基因区域的精细物理图谱,利用该物理图谱采用染色体步行(chromosomewalking)的方法逐步逼近目的基因。图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥(Arobi󰀁dopsisthaliana)。应用该方法,傅廷栋等[1]成功分离了拟南芥雄性不育基因BnMs2;Pan等[2]分离到了一个新的水稻细胞色素P450基因CYP81A6,这个基因对2种除草剂具有抗性;Paul等[3]在拟南芥中分离到了与拟南芥根尖铝元素运输和敖合相关的基因ALS1󰀁1。2󰀁转座子或T󰀁DNA标签法(transposonorT󰀁DNAtaggingmethod)󰀁󰀁此法的基本程序为:首先进行突变体的诱变和鉴定工作,然后以转座子或T󰀁DNA作为标签DNA制成探针或引物,筛选突变体基因组文库,用反义PCR(IPCR)技术分离出标签DNA两侧目的基因部分序列,再依据序列设计探针或引物筛选野生型基因组文库,即可分离出完整的基因,最后用基因互补测验检测其功能。现在又发展了一种转座子捕捉(transposontraps)的手段来捕捉那些无表型突变的基因,包括有增强子捕捉和基因捕捉两种类型。在植物中利用的转座子系统有Ac/Ds、Mutator等,其中以Ac/Ds双因子系统利用最多。目前应用该方法已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圆斑病基因Hm1,Hm2,番茄抗叶霉病基因Cf󰀁2,Cf󰀁4,Cf󰀁5,Cf󰀁9及Cf󰀁ECP2等[4]。黄海宁等[5]应用转座子标签法克隆了对阴沟肠杆菌B8中与抗水稻白叶枯病菌拮抗活性相关的DNA片段。3󰀁同源序列法(homology󰀁basedcandidategenemethod)󰀁󰀁其基本思路分为两种:󰀂根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物,并用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增,再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。 生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列,基于此原理,在其它种属同源基因被克隆的前提下,构建cDNA文库或基因组文库,然后用已知分子高保守序列制备同源探针,经标记后从相应的文库中筛选阳性克隆,并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因[6]。应用此方法,Tang等[7]利用拟南芥同源序列克隆到了DsFAD3,DsFAD7和DsFAD8的全长cDNA。4󰀁表达序列标签法(expressedsequencetaggingmethod,EST)󰀁󰀁EST指的是一组cDNA的部分序列,一般长度为150~500bp,是由大规模随机挑选的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。用EST或多个EST序列组装的基序与公共数据库的基因进行!电子杂交∀,进而可以从理论上推测其所代表的基因的功能。经电子杂交基因筛选后的EST及其延伸基序可作为某一基因标签,结合PCR技术克隆新基因,其过程如下:首先以该标签序列提供的信息设计合成基因特异引物(GSP),再用Oligo(dT)对mRNA进行反转录的同时加上锚定引物,然后在总RNA中,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得目的基因的全长序列;或者是用该标签序列提供的信息设计引物,合成探针对cDNA文库进行筛选,挑取最长的阳性克隆进行测序,以期获目的基因。近来人们利用该技术分离到了小麦慢条锈病抗性基因Lr46[8]。5󰀁差异表达基因的分离技术植物个体在不同的外部环境因素的影响下会表现出各种各样的特性,比如在逆境胁迫下,植物一般都会表现出各种抗逆性状,这主要是由于其内部基因表达差异所致。而这种差异主要表现在两个方面:一是基因表达种类的不同,二是基因表达水平的不同。差异表达基因克隆技术一般需要两种或两种以上不同的组织群体,其中一种或几种是目的基因不表达或异常表达([+]),而另一种是目的基因正常表达([-]),然后制备两种不同的mRNA,反转录PCR并制备两种cDNA探针,分别与表达目的基因的cDNA文库进行杂交筛选,选出只与[+]探针杂交而不与[-]探针杂交的克隆,或与[+]探针高度杂交而与[-]探针杂交信号很弱的克隆,从而检测出特异表达的克隆,并进行后续的分子生物学功能研究[9]。郭宾会等[10]利用DDRT󰀁PCR(mRNA差异显示技术)于苗期进行水分胁迫诱导检出15个阳性克隆,11个片段序列与已知序列有较高的同源性,4个片段同源性非常低,可能为新基因。田振东等[11]用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个马铃薯富集晚疫病抗性相关基因的差减文库,应用反向Northern技术筛选出150个病原诱导后信号明显增强的克隆。6󰀁cDNA捕捉法(cDNAcapturation)cDNA捕获法是一种以表达为基础的基因分离技术,用YAC探针或基因组探针直接捕捉cDNA或基因组DNA,可以快速从大的基因组区域分离表达序列。目前常用的方法有:󰀂用YACs探针直接筛选cDNA文库,获得目的基因; 将cDNA固定于尼龙盘上,用两侧带有载体序列的短的随机片段与其杂交,再用载体引物做PCR和巢式PCR,再酶切克隆;#先从组织中提取mRNA,合成双链cDNA,用Cot1DNA预杂交封闭重复序列,再流式细胞仪分选染色体[12],DOP󰀁PCR(degenerateoligonucleotideprimed)并生物素化,与已封闭的cDNA杂交,再用链亲和素包被的磁珠捕捉cDNA,严格洗脱后,PCR扩增后进行第二轮筛选,最后对cDNA进行染色体作图。杨存义等[13]利用cDNA捕捉法,获得了6个水稻杂种不育基因Sc座位附近区域基因组的幼穗表达序列。7󰀁cDNA微阵列技术(microarray)cDNA微阵列技术是以Northern印记杂交为基础,采用大规模集成电路点样技术的一种DNA杂交微阵列技术,是基因分离鉴定的最有效的方法之一。该技术流程包括四大部分:基因资料库以及载有基141󰀁第2期邵󰀁珏,等:获取基因全长cDNA策略及应用因片段的细菌库、微阵列点样系统、样本标定及杂交、讯号获得及分析系统。cDNA微阵列的制作主要是将基因资料库中的mRNA逆转录成cDNA,制成探针cDNA片段,由PCR扩增、纯化,机器人点样于玻璃片或是尼龙薄膜上。当比较两个样品中基因表达差异时,则将两个样品的总mRNA提取出来,在反转录时分别以不同颜色的荧光物质(Cy3和Cy5)或是生物素进行标定。然后一起混匀,与微阵列上的探针cDNA杂交。在清洗处理后,再以适当的探测方法获得杂交后的影像,以显微镜照射每一个cDNA样点,分别测量两种荧光染料在该点的荧光强度,并计算其比值。然后用适当的软件以及分类逻辑进行讯号分析以及群组分类,将微阵列所得到的大量基因讯号,转换成有生理意义的讯息[14]。刘妍等[15]应用基因表达谱芯片技术克隆到了甘草甜素诱导Jurkat细胞后的差异表达基因;Yu,etal[16]获得了一个与人类神经胶质瘤相关的全长基因。生物技术和信息技术发展日新月异,寻找新基因或新基因cDNA全长的策略和方法也在不断更新,正朝着快速、简便、经济、准确的方向发展,无论哪种方法,各有其优缺点,研究者应根据自己的实际情况,选择合适的技术,以达到自己预期的目的。参考文献:[1]LeiSL,YaoXQ,YiB,etal.Towardsmap󰀁basedcloning:finemappingofarecessivegenicmale󰀁sterilegene(BnMs2)inBrassicanapusL.andsyntenicregionidentificationbasedontheArabidopsisthalianagenomesequences[J].TheorApplGenet,2007,115:643–651.[2]PanG,ZhangXY,LiuKD,etal.Map󰀁basedcloningofanovelricecytochromeP450geneCYP81A6thatconfersresistancetotwodiffer󰀁entclassesofherbicides[J].PlantMolBio,l2006,61:933󰀁943.[3]LarsenPB,CancelJ,RoundsM,etal.ArabidopsisALS1encodesaroottipandstelelocalizedhalftypeABCtransporterrequiredforrootgrowthinanaluminumtoxicenvironment[J].Planta,2007,225:1447-1458.[4]梁锦锋,于红卫,叶国平.植物新基因克隆策略和技术进展[J].安徽农业科学,2007,35:7112-7114.[5]黄海宁,余旭平,陈卫良,等.转座子标签法对阴沟肠杆菌B8拮抗水稻白叶枯病菌相关基因片段的克隆与检测[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2006,32:265-269.[6]李󰀁鑫,章󰀁涛.新基因的克隆策略和方法[J].海峡药学,2004,16:16-20.[7]TangSY,GuanRZ,ZhangHS,etal.Cloningandexpressionanaly󰀁sisofthreecDNAsencodingomega󰀁3fattyaciddesaturasesfromDe󰀁scurainiaSophia[J].BiotechnolLett,2007,29:1417-1424.[8]MariaMH,RaviPS,ScotH,etal.TargetedmappingofESTslinkedtotheadultplantresistancegeneLr46inwheatusingsyntenywithrice[J].FunctIntegrGenomics,2006,6:122-131.[9]谢伟伟,王凭青,杨青川,等.植物差异表达基因克隆技术及研究进展[J].重庆大学学报(自然科学版),2005,12:97-100.[10]郭宾会.小麦苗期水分胁迫诱导差异表达cDNA的研究[J].生物技术通报,2003,2:40-44.[11]田振东,柳󰀁俊,谢从华.利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因[J].遗传学报,2003,30:597-605.[12]VeyretR,ElaissariA,DelairT.Polyelectrolytefunctionalizedmag󰀁neticemulsionforspecificisolationofnucleicacids[J].ColloidsSurfBBiointerfaces,2006,53:78-86.[13]杨存义,刘耀光.cDNA捕捉法获得水稻杂种不育基因座位Sc区域的编码序列[J].西北植物学报,2004,11:1985-1989.[14]郑󰀁琳,赵明光,毕玉蓉.cDNA微阵列技术:一种有效的差别表达基因克隆新方法[J].ChemistryOfLife,2003,1:73-75.[15]刘󰀁妍,成󰀁军,杨󰀁倩,等.应用基因表达谱芯片技术克隆甘草甜素诱导Jurkat细胞后的差异表达基因[J].WorldChinJDi󰀁gesto,l2004,12:70-73.142健康研究2009年󰀁