第7章 基因功能分析的基本策略
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基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物:是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内,并能稳定传代的一类动物。
2基本原理:将目的基因(或基因组片段)用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中,使目的基因整合到基因组中,然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管(或子宫)中,使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶:是指通过DNA定点同源重组,改变基因组中的某一特定基因,从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因,称为基因敲除,若定向将一段基因序列替代另一段基因序列,称为基因敲入。
2同源重组:是指发生在同源序列间的重组,它通过链的断裂和再连接,在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除:是目前在体内研究基因功能的最佳方法,是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA,从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件:胚胎干细胞(ES)、打靶载体5打靶载体的筛选标志:neo(新霉素)阳性筛选标志;HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序:①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段,将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中;②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列,只留部分序列在线性质粒载体的两端;③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中,使之位于残留目的基因同源顺序的中间;④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体,将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。