现代生物技术概论复习提纲

现代生物技术概论复习提纲第六章蛋白质工程1. 了解蛋白质分子之间的相互作用；蛋白质的亚基可以被解离成游离亚基，在一定条件下又可以重新聚合；某些具有四级结构的蛋白质分子之间，亚基可以聚合，产生有活性的杂交分子；不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组成，都能聚合成聚合物。

2. 蛋白质工程的基本任务；以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现有的蛋白质加以定向改造、设计和构建，最终生产出比自然界存在的蛋白质更优良、更符合人类需求的功能蛋白质。

3. 图6-6蛋白质工程研究策略，利用反向生物学手段；蛋白质工程的主要研究手段：利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其生物活性的高低程度。

4. 改变先有蛋白质结构的基本步骤；①分离纯化目标蛋白质。

②分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。

③根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。

④根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。

⑤对目的基因进行人工定点突变。

⑥改造后的基因在宿主细胞中表达。

⑦分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达到设计目的。

5. 改变蛋白质结构的核心技术包括基因的人工定点突变和蛋白质的人为进化，具体内容；（1）基因人工定点突变技术：①M13载体法：该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。

②PCR扩增法：该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因。

PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。

（2）蛋白质的人为进化易错PCR和DNA shuffling （DNA改组）单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段。

无引物PCR，具有互补3'末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。

最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。

对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮shuffling循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。

6. 举两个蛋白质工程的应用实例；（1）胰蛋白酶：223个氨基酸残基和以异亮氨酸为N端的单肽链。

Arg117位自溶点的缺失突变，得到缺失突变体，其结果表明该突变体的稳定性明显提高。

将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa值，在pH较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。

（2）金属硫蛋白：富含半胱氨酸的小分子蛋白，半胱氨酸巯基可以结合大量的金属元素；金属硫蛋白由α和β结构域组成。

在烟草中转入串联的α结构域基因后，提高了重金属抗性。

7. 蛋白质组学研究的三个领域；(1) 蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学研究。

(2) 针对有关基因或转录组数据库的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学研究。

(3) 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要的生理/病理体系或过程的局部蛋白质研究，即比较蛋白质组学研究。

8. 蛋白质组分析的基本过程（并参考课件上放的文献的步骤）①样品制备（溶解、解聚等）②分离（双向凝胶电泳）③图像分析④蛋白质成分的分析与鉴定⑤蛋白质组研究中的样品制备第七章生物技术与农业1. 利用生物技术诱导植物雄性不育的方法①组织培养诱导植物雄性不育中国水稻所利用巴斯马提水稻品种进行胚根组织培养，然后将愈伤组织进行辐射，从而选育出巴斯马提雄性不育系。

②基因工程诱导植物雄性不育花粉绒粘层表达barnase基因阻断花粉正常的发育而造成败育，形成不育系；花粉绒粘层表达bastar基因转化植株中为恢复系形成的二系配套的油菜、烟草。

反义RNA技术创造了拟南芥、玉米、油菜等植物不育系。

③原生质体融合创造不育系萝卜与油菜的原生质体融合而产生的细胞杂种——萝卜质油菜，在一般环境条件下表现为“雄性不育”。

匈牙利国家自然科学院Menczel等以链霉素抗性基因作标记在烟草品种间进行原生质体融合，实现了烟草细胞质雄性不育基因的转移。

2. 生物技术育种的一个重要应用是抗逆育种，通过了解各种抗性育种的实例（了解一个例子），掌握生物技术抗性育种的方法。

P159在一定逆性环境选择压力下，采用组织培养、原生质体融合和体细胞杂交等生物技术手段，可以定向筛选具有抗逆性的个体，培育抗逆新品种。

培育抗病毒作物：植物病毒是造成农作物减产的主要原因之一。

利用基因工程技术将抗病毒基因转移到植物中，是一种比较理想的抗病毒方法。

抗病毒基因工程通常采用的策略是：病毒外壳蛋白基因或其功能蛋白基因、病毒亚基因组序列、卫星DNA、缺失干扰型序列的遗传转化；反义RNA技术等。

➢烟草花叶病毒TMV外壳蛋白基因引入到烟草细胞中，转化植株的细胞中可以产生这种外壳蛋白，并对TMV感染表现出一定的抗性。

➢将TMV编码的一种蛋白质(分子质量54kDa)的DNA序列导入植株时，可对高浓度的TMV产生抗性。

为了赋予植株以病毒抗性，此特殊的DNA序列要比迄今利用的外壳蛋白基因更有效。

3. 了解植物细胞工程应用的内容，掌握标题就可以。

①植物次级代谢产物的生产；②快速无性繁殖；④花药、花粉和胚的培养；④原生质体的融合；⑤细胞遗传操作；⑥种质资源保存4. 何为生物农药，了解几种主要制剂。

生物农药是“可用来防治病、虫、草等有害生物的生物体本身或源于生物，并可作为‘农药’的各种生理活性物质”。

生物农药可分为生物体农药和生物化学农药。

生物农药本身具有的对人畜毒性小，只杀害虫，与环境相容性好以及病虫害相对不易产生抗性等优点。

苏云金芽孢杆菌（Bt）：Bt是当前国内外研究最多，应用最广泛的杀虫细菌。

目前正朝着大吨位、多品种的方向发展。

在苏云金杆菌几十年的开发利用过程中，人们在生物技术育种、发酵工艺改进、新剂型研制、新产品开发等方面取得了不同程度的进展。

白僵菌：白僵菌是用于防治多种鳞翅目害虫的真菌制剂，目前已进入工业化生产和较大规模应用的虫生真菌有球孢白僵菌、卵孢白僵菌、金龟子绿僵菌等。

昆虫病毒：昆虫病毒杀虫剂也是生物防治的重要手段之一，这类杀虫剂具有特异性强、毒力高、稳定性能好、安全无害等优点。

进入20世纪80年代以后，这类杀虫剂的研究主要集中在昆虫病毒复合剂的研制、病毒的活体增殖、病毒的提取、基因工程病毒杀虫剂的研究及昆虫病毒培养等领域，并都取得了显著的成就。

5. 动物转基因技术中，导入外源基因的主要方法。

①显微注射法：原核期胚胎的显微注射②病毒载体法：反转录病毒载体感染③脂质体介导法：脂质体人工膜包裹DNA④精子介导法：成熟精子携带外源DNA入卵⑤胚胎干细胞法：全能性干细胞携带外源基因导入胚胎6. 动物转基因技术的主要目标●促进动物生长，提高产量；●改良品质性状，提高产品品质；●增强动物抗病能力和抵抗不良环境能力，提高生产效益；●研制动物生物反应器。

7. 总结课本上转基因鱼的研究目的，如包括提高生长速度、抗冻等；①在理论方面为动物发育机制和基因功能研究提供方法：转基因鱼的生产性研究集中在提高生长速度和抗逆性。

②提高生长速度：生长激素提高鱼的生长速度，显示出转基因鱼在渔业生产和水产养殖业的潜在经济价值。

③扩大优质鱼种养殖范围：抗冻基因蛋白技术提高鱼类的抗寒能力，由此可以南鱼北养。

④开辟鱼类抗病新途径：基因鱼研究引进反义RNA技术。

⑤培育观赏鱼新品种：转荧光蛋白基因的转基因鱼。

8. 总结家禽转基因的方法，及鸡作为生物反应器的优点。

P169方法：生产转基因鸡的方法可分为蛋产出前的操作和产出后的操作两种类型。

✧蛋产出前，在受精后第一次卵裂前取出单细胞的卵✧蛋产出后，病毒载体法，胚胎干细胞法和原生殖细胞法。

✧精子携带基因。

鸡作为生物反应器具有突出的优点：第一，对鸡自身具有安全性。

第二，鸡的输卵管是有效的蛋白质合成器，乱清蛋白启动子可调控其下游的外源基因的表达，合成的基因产物可进行正确的修饰和加工，产物的生物活性接近天然动物个体。

第三，鸡输卵管表达外源蛋白具有遗传稳定性，一旦获得可生产有价值蛋白质的动物个体，可用常规畜牧技术建立转基因鸡的家系。

即作为生物反应器还具有哺乳动物所不具有的优点：产物易收集，且不易污染；鸡蛋成分简单，产物易分离；鸡饲养成本低，世代间隔短。

用鸡蛋生产珍贵的药物外源蛋白，是转基因鸡生产的一个十分诱人的领域。

9. 动物繁殖新技术包括？这些技术可作名词解释。

P171①人工授精及精液的冷冻保存人工授精就是利用合适的器械采集公畜的精液，经过品质检查、稀释或保存等适当的处理，再用器械把精液适时地输入到发情母畜的生殖道内，以代替公母畜直接交配而使其受孕的方法。

②胚胎移植：是将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种的生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体。

胚胎移植实际上是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。

③胚胎的冷冻保存●胚胎冷冻保存技术包括胚胎的冷冻和解冻。

●抗冻剂种类和浓度、加入抗冻剂的速度、解冻的速度、稀释的速度和温度都关系到冷冻胚胎的成败。

●抗冻剂的毒性、胚胎渗透压的变化及冰晶形成是保存胚胎必须考虑的因素。

④体外胚胎生产●体外胚胎生产是指将原来在输卵管进行的精卵结合生成胚胎的过程人为地改在体外进行。

●体外生产胚胎的工艺过程包括卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎培养。

⑤胚胎分割：是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体子宫中发育，以得到同卵双生或同卵多生后代。

⑥性别控制技术动物的性别控制是指通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖所需性别后代的技术。

性别控制的技术主要采用两条途径，即X精子和Y精子的分离和胚胎性别鉴定。

⑦发情、排卵及分娩控制发情和排卵控制是有效地干预家畜繁殖过程，提高繁殖力的一种手段。

它包括诱发发情、同期发情和超数排卵等技术措施。

10. 什么是动物生物反应器，其应用前景如何。

动物生物反应器：是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。

应用前景：动物生物反应器的研究开发重点是动物乳腺反应器和动物血液反应器。

即把人体相关基因整合到动物胚胎里，使出生的转基因动物血液中，或长大后产生的奶汁中，含有人类所需要的不同蛋白质。

这是当前生物技术的尖端和前沿研究项目。

乳腺生物反应器成功的关键是转基因动物乳腺能特异性表达外源蛋白质基因。