波恩氏固定液：苦味酸饱和液（0.9-1.2% ）75ml 冰醋酸5ml 40% 甲醛（也就是100%畐尔马林）25ml
一.石蜡切片的主要流程为：
1）取材与固定：将两年龄的各种样本的性腺组织放入干净的EP
管中，然后倒入波恩氏固定液，固定3?4个小时；
2 ）脱水：组织经固定后，去除固定液，然后逐级脱水，
70%^80%^90%^纯酒精（I）-纯酒精（II），每级脱水处理40分钟左右；
3）透明：脱水后，用二甲苯置换组织中的酒精，纯酒精（II） -1/2纯酒精+1/2二甲苯-二甲苯（I）-二甲苯（II），同样的每级处理40分钟左右。
4）浸蜡：将已透明的样本放入放置在60摄氏度左右的恒温箱的液体石蜡中，浸蜡4小时左右；
5）包埋：用牛皮纸折叠成合适大小的小盒，然后将熔化的石蜡和样本材料倒入盒中，用在酒精灯上略热的镊子将样本材料安放整齐，直至冷却；
6）切片：首先用单面刀片把石蜡块修整好，然后将其固着在台木上，最后固定在石蜡切片机上开始切片；
7）贴片：将切片机切下的蜡带按载玻片大小分割成小段粘贴在
载玻片上，为使粘贴牢固先在在玻片上滴一小滴蛋白甘油，涂抹均匀，
然后再滴一滴干净的水在上面，将分割好的蜡带轻轻的放在上面，然后移到烫板上；
8）染色：以粘贴牢固的切片脱蜡下降至水（每级处理2~5分钟）
T苏木精中染色4分钟左右T水洗T氨水中蓝花” 1~分钟，蒸馏水
漂洗一次T0.2%署红水溶液半分钟左右T70%的酒精过一下T95% 的酒精浸几下T纯酒精（I）2分钟T纯酒精（II）2分钟T 1/2纯酒精
+ 1/2二甲苯2分钟T二甲苯2分钟；
9）封片保藏：将染色好的切片封藏于中性树胶中。
透射电镜技术材料准备的主要流程为：
1）用干净的镊子和剪刀剪取合适大小的性腺组织，用3%的戊二醛固定4~5小时；
2）用磷酸缓冲液清洗几次后用锇酸固定；
3）系列丙酮对其梯度脱水后用Epo n812包埋；
4）超薄切片机60~70 nm厚度超薄切片，然后用醋酸双氧铀 -枸掾酸铅染色；
5）利用日本H -600透射电子显微镜对其进行观察；
6）参照刘筠等采用的鲤科鱼类的分期标准对其进行性腺分期。
二.肾脏细胞染色体制备步骤为：
1）试验鱼在药物注射前先在18C~22C的水体中培养两天，然后按8~10卩g/鱼体重注射植物血细胞凝集素（PHA）三次，间隔时间为第二次注射离第一次12~14h,第三次离第二次4~5h，其中第二次注射
的剂量为第一次剂量的1.5倍，在试验鱼解剖前1.5~2h,按2 -4卩g/g 鱼体重的剂量注射秋水仙素碱；
2）放血，开始解剖试验鱼。用手术剪从试验鱼泄殖腔处朝前贴近肚
皮剪开试验鱼腹腔，用镊子取出位于背部的糜烂状的肾脏组织，放于
盛有0.8%的生理盐水的培养皿中，挑出黏膜组织后用干净的剪刀将其尽量剪碎；
3）将剪碎的肾脏组织全部转入洁净的10 mL离心管中，静置沉淀5min 后将上清转至另一洁净的10 mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清液；
4）先向离心管中加入1~2ml 0.075 M KCI低渗液，用干净的吸管迅速
将沉淀下来的肾脏组织吹打均匀，然后加至10mL体积，低渗
45min~1h，每隔10min轻轻吹打一次；
5）预先加入1 mL卡诺氏固定液（甲醇和冰醋酸（3：1）混合液）轻轻混匀后预固定30s后1000rpm离心5分钟，弃上清液；
6）加入5mL固定液，轻轻混匀，静置20分钟后1000rpm离心5分钟，弃上清液；
7）重复步骤6 一次；
8）视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液（一般为1?
2mL ）后，吸取细胞悬液自20?30cm高处滴片（预先冷冻的玻片），轻吹散，酒精灯上烤片10~15s后空气中自然干燥；
9）Giemsa染液染色20?40分钟，细水流冲洗载玻片背面去除染液，气干后镜检，用Pixera pro 600 ES （美国）数码显微图像采集、分析、处理系统拍照。
三.外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：
1）在超净工作台中配制培养基，100mL培养基含以下成分：84mL
RPMI -640, 15mL 小牛血清，2 支PHA, 1mL 0.1%肝素钠，以7.5% NaHC03 (无菌)或1N HCI 调pH 至7.2?7.4;
2) 用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；
3) 按每10mL培养液中加入约0.2mL抗凝血的标准将抗凝血加入培
养液中，于24C 5%二氧化碳浓度的培养箱中培养68?72小时，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；
4) 终止培养前2~4小时，在培养液中用1mL注射器滴加入10血/mL 的秋水仙碱，使终浓度为0.05?0.07卩g/m。以上步骤均需无菌操作；
5) 后续的染色体制备流程与肾脏细胞染色体制备相应步骤相同。
四.参照Sox基因保守的HMG框序列利用引物设计软件Primer Premier
5.0和Jellyfish 2.1设计和合成了一对简并引物：
HMG (+): 50 〒GAAGCGACCCATGAA(C/T)G - 3'
HMG ( -: 50 -\GGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)T - 3'
用来扩增三种不同倍性水平杂交鱼后代及其亲本的So＞基因。
1.Sox基因PCR反应程序为：首先94C预变性5min，然后94C 变性30 s 52 C退火45s、72 C延伸80s 35个循环，最后72 C终延伸10min,最后在4C保存
2.将溶胶用移液枪转至套放在2mL收集管内的UNIQ -0柱中，
室温放置2min, 8000rpm室温离心1min; 5、倒掉收集管中的废液，
将UNIQ -0柱放回收集管中，加入500此Wash Solution, 8000rpm
室温离心1min; 6、重复步骤5 一次；7、倒掉收集管中废液，将柱
放回，12000rpm室温离心15s; 8、将UNIQ-0柱放入一新的1.5mL 的离心管中，在柱子膜中央加入40~70此在60C烘箱中预热的Elution buffer 或去离子水（PH>7.0）; 9、12000rpm 室温离心1min; 10、回收的目的片段琼脂糖凝胶电泳检测，然后-20 C保存。回收的DNA 片段连入pMD18 -载体（10山连接体系为：5gL Ligation Solution, 4此回收目的片段，1此PMD18〒载体。），在22C水浴锅中连接12-4小时。使用热激法将连有目的片段的载体转入大肠杆菌（DH5a）感受态细胞中，涂板、37C恒温培养，整个操作过程均按pMD18 -载体试剂盒（大连Takara公司）说明书进行。利用菌液PCR方法（20山反应体系包括：10山2 >Pfu PCR MasterMix缓冲液
（北京天根），正负引物各1山，菌液1此,7山去离子水）挑选阳性克隆。挑选的阳性克隆被送往上海生物工程公司（Sa ngon进行序列测定。五?探针制备及FISH
25此标记体系为：12.1 L去离子水，2.5 L Buffer, 2.5 k Dig -UTP, 2.5 L 正负引物，2.5 L 质粒DNA , 0.4 L Tap聚合酶。同时设空白试验一组。PCR反应程序与5S rDNA扩增反应相同。标记后的产物经检测纯化后-20 C保存备用。55 k L纯化体系包括：6此NH4AC, 1 g L糖元，48山
标记探针。纯化流程为：首先，向装于1.5mL 离心管中的纯化体系中加入200 g L零下20C保存的纯酒精，置于零下80C中30min，然后4C 12000rpm离心10min,倒除上清后加入200 L 70%酒精混匀，然后4C
12000rpm离心5min后去上清，再加
1225山甲酰胺，室温溶解10min后零下20C保存备用。13山探针杂交混合液的配制：2gL 20 >SSC, 5此纯化后的标记探针，4山去离子甲酰胺，2山50%硫酸葡聚糖。配制完成后零下20C保存备用。荧光原位杂交（FISH）
将制备的染色体临时装片室温下老化至少两天或于60C烘箱中
烘焙2￡h,然后转入含有30⑷/ml RNase A的2 x SSC中37C放置30分钟。晾干后染色体临时装片置于70C的70%去离子甲酰胺（用 2 X SSC
配制）中变性2分钟，再用70%￡0%-00%浓度的酒精梯度脱水各5分
钟，然后风干。将4此杂交混合液（包括大约100ng的标记探针，50%的甲酰胺，10mg/mL的硫酸葡聚糖和2X SSC）置于100C沸水中变性10mi n,然后将其加至风干的变性临时装片上，用一面积为22 X22mm的盖玻片从侧面轻轻盖上，杂交液扩展均匀后四周用封口膜封严实，放入一湿盒中，37 C杂交过夜。
第二天，在避光的环境下，移去封口膜和盖玻片，在43 C水浴
锅中将杂交后的玻片依次在50%甲酰胺/2 XSSC中漂洗15分钟两次，在2 XSSC和1 X SSC中漂洗5分钟各一次，然后风干。再将8此的浓度为5 gg/mL的FITC -抗-DIG抗体加至玻片上，用盖玻片轻盖均匀后放入湿盒中于37C恒温箱中孵育20分钟。取出玻片，小心移去盖玻片，在43 C的TNT洗液中漂洗5分钟三次，风干。加8gL浓度为2 ug/mL的4',6-二脒
基--苯基吲哚（DAPI ）对玻片背景染色5 分钟。最后，避光环境下玻片用Leica CW4000显微镜和Leica LCS SP2 共聚焦成像系统进行检测和拍照。
获得的图片用Adobe Photoshop cs4 进行后期处理，至少30个中期分裂相图片用来分析荧光原位杂交
（FISH）结果。
精子外形观察
肾细胞取材之前用手挤实验鱼的腹部，并用干净的吸管吸取刚刚挤出的精液，用3%的戊二醛在4e下固定4 一10小时,轻轻混匀后滴加于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，用磷酸缓冲液冲洗3次每次10分钟”随后在1%的饿酸中固定1小时磷酸缓冲液冲洗3次,酒精梯度脱水，叔丁醇浸泡2小时,冷冻干燥仪干燥，离子溅射镀金，最后用x 一650（HITACHI）sEM扫描电镜观察并摄影。
团头妨卵子直径为0.11 士0.02cm红螂卵子直径为0.13 士0.01cm
中山大学黄染色体步骤
1）注射：试验鱼腹腔注射PHA（10ug/g）, 22小时后注射相同量的PHA，三小时后注射秋水仙素（3ug/g）;
2）取肾：注射秋水仙素4小时后剪尾放血，放血30分钟，解剖取头肾，将头肾组织放入生理盐水中清洗2-3遍，将头肾组织放入装有生理盐水的离心管中剪碎，用400目筛绢过滤移入另一个新的离心管，1000rpm,
8min 离心；
3）低渗：离心后去除上清液，加入0.075mol/LKCI液，37C中低渗30分钟；
4）固定：将低渗处理好的细胞1000rpm离心8min，弃上清，加入6ml
卡诺氏固定液，用吸管吹打均匀，静置20min,离心弃上清液，
重复两次；
5）滴片：加入1-2ml固定液，吹打均匀每张玻片滴1-2滴，空气中干燥；
6）染色：用10%Giemsa染液染色30min，自来水冲洗，晾干；
7）镜检：选取分散均匀的中期分裂相拍照，统计染色体个数。
说明 石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。文档来自于网络搜索 取材 应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。文档来自于网络搜索 固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa 液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。文档来自于网络搜索 洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相
动物病理组织学 石蜡切片制作标准操作程序（SOP） 一、\器材和试剂准备 （一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡； （6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用； 注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理 （1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。 或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。 （2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。 二、石蜡组织切片的制作 （一）取材 注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
石蜡切片的制作 试验药品和仪器 试验药品：酒精、二甲苯、石蜡、番红、固绿、冰醋酸、甲醛、明胶、甘油、石碳酸、中性树胶。 试验仪器：石蜡切片机、组织包埋机、水浴锅、染缸、烘箱。 试验方法 1 叶片组织结构的观察 对叶片组织结构的观察采用石蜡切片法。具体操作步骤如下： 1. 取材。选取生长良好的叶片，用水清洗干净，擦干，沿主脉切取2mm x 5mm 的小段。 2. 固定。将切取的植物材料立即放入FAA 固定液中（材料与固定液比例1:20），用真空泵抽气（使固定液尽快渗入材料中，并排除材料内气泡的干扰），固定时间 48h以上。FAA固定液配方：50%酒精、冰乙酸、甲醛（37%-40%）按18:1:1的比例配置。 3. 冲洗。材料从固定液中取出后，用70%的酒精冲洗3次，每次间隔2h,并在70%酒精中过夜。 4. 脱水。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为 了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行：70%酒精一80%酒精一95%酒精一无水酒精一无水酒精，每级酒精中放2h，无水酒精分2次，一次2h。 5. 透明。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍 1?2小时，再转入纯透明剂中浸渍。具体为：1/3二甲苯+2/3无水酒精（加番红染色，以便透明后找到材料）一1/2二甲苯+1/2无水酒精一2/3二甲苯+1/3无水酒精一二甲苯一二甲苯，每级二甲苯中放2h，纯二甲苯分2次，每次放1h。材料进入无水的透明剂
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
石蜡切片制作 一、木精-伊红对染法 ——paraffin section 一、器材及试剂： 1. 器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性树胶。 3. 材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL 磷酸氢二钠 6.5 磷酸二氢钾（钠） 4g
双蒸水 900mL 2．木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸 1份 70%酒精 100份 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中 固定，固定30－50min。（4度过夜） 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化 学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合 太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间 应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材 料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签 上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 3. 洗涤 材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 4. 脱水
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
石蜡切片的制作 石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，它有很多优点，例如，比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存等。缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆，制片时间太长。 一、石蜡切片的制作过程 石蜡切片的制作过程主要是：取材→水洗→固定→水洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→染色。 （一）取材及水洗 根据实验要求选取材料来源及部位，取要求部位的小块组织成为组织块，组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时，因此一般情况下，将动物处死后立即取需要的材料。 组织块取下后，先用相应的生理盐水漂洗以洗去血液、污渍以及粘液等。如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 （二）固定 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内
液的用量与组织块体积之比一般在20:1，不应使组织块贴于容器壁上。材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。固定的时间长短依据材料大小而定。 固定液有许多种，在固定的过程中应该根据需要选取合适的固定液，一般固定液都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化而失去固定作用。有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早固定时就没有作用了。 （三）水洗 固定液的颜色以便后续的染色。水洗时，一般将其置于水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。 （四）脱水 固定之后的组织要进行脱水。由于组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。乙醇既可做固定剂也可做为脱水剂，再用酒精脱水的过程中，首先用50%的酒精进行脱水，然后再依次增加酒精浓度，直到最后用100%的酒精进行脱水。如50%→60%→70%→80%→90%→95%→100%，使用100%的酒精可以脱水两次到三次。脱水的时间应该视组织块的大小而定。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 （五）透明
免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。
（一）材料与用具 1．材料： 鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。 2．用具： 溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 （二）实验内容与步骤 1．取材及固定 取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过 0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。 组织块取下后，先用 0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。 如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗
固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。 在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。 简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4．透明
常规石蜡切片制片规范 1．制片过程中的每一个环节，应确保切片号和蜡块号一致，自始至终不能将号码弄错，一旦发生应重新取材，以防事故发生。 2．制片完成后，应在HE切片上及时粘贴写好本病理科病理号的标签，并认真仔细地核对。 3．认真检查制片质量。切片优良率（甲、乙级片所占的比例）≥90％，优级率（甲级片所占的比例）≥35%。不合格切片应立即重做。4．制片完成后，技术人员应将所制作的切片连同相应的申请单/记录单、取材工作单等一并移交给病理医师，双方经核对无误后，办理移交签字手续。 5．制片工作一般应在取材后2个工作内完成（需要脱钙、脱脂等特殊处理的除外）。 6．制片过程中如发生意外情况，有关技术人员和技术室负责人应及时向病理科主任汇报，并积极设法予以补救。 7．具体HE切片制作技术参见《病理组织学常规制片技术》。 附： 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，应迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为 2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。 (7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
HE染色 1.取材 切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项: (1取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。 2.固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。 注意事项: (1一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。 (2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。 (3固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。 (4材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液
镊子触质粒由硬变韧性为准。 (美:固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。(20,30,30,60 (美:流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min 注意事项: (1脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。 (2在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 (4在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。 (5如需过夜,应停留在80%酒精中。 (6脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象 (美:80%的酒精×2小时 95%的酒精×2小时 100%的酒精×2小时×2
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。
小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包 埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其 组织结构。 二、材料与用具 1 ?材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2 ?用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1 .取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组 织块。用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污 物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是 管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 , 固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2 .冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3 .脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换 出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6?12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr 左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆 的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15?30 min左右。在脱水瓶中酒 精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4 .透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒 精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经