活血祛瘀法对真性红细胞增多症细胞凋亡及相关基因表达的影响
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活血祛瘀法对真性红细胞增多症细胞凋亡及相关基因表达的影响
杨洪涌－，孙金芳ｚ，陈志雄，，赵珍品一，古学奎ｔ，刘安平‘（１．广州中医药大学第一附属医院，广州５１０４０５；２．广
州中医药大学，广州５１０４０５；３．广州市中医医院，广州５１０１３０）
摘要：目的探讨活血祛瘀法治疗真性红细胞增多症的作用机理。方法选取真性红细胞增多症初治或未缓解的住
院及门诊患者１０例，以活血祛瘀药治疗１２周，并设立正常对照组。在治疗前，治疗１周、４周、８周、１２周采用
ＴＵＮＥＬ法检测患者骨髓单个核细胞的凋亡率，以免疫组化法检测治疗前后Ｂｃｌ一２、ｐ５３基因，用原位杂交法检测上述基因ｍＲＮＡ表达。结果治疗后１周、４周、８周，患者骨髓单个核细胞凋亡率较前一个观察时点逐步增高（Ｐ
值均小于０．０５）；但治疗后１２周与治疗后８周比较，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。治疗前患者Ｂｃｌ一２基因及其ｍＲ．ＮＡ、ｐ５３基因及其ｍＲＮＡ水平均高于正常对照组（Ｐ＜０．０５）；治疗后４周Ｂｅｌ一２ｍＲＮＡ、治疗后８周Ｂｃｌ一２基因及其ｍＲＮＡ、治疗后４周和８周ｐ５３基因及其ｍＲＮＡ表达均低于治疗前（Ｐ＜０．０５）。结论活血祛瘀法治疗真性红细胞增多症的起效时间可能在治疗后第８周达到高峰，此后若继续用药，其疗效可能趋于平稳。其机理之一可能是通过调节Ｂｃｌ一２、Ｐ５３基因及其ｍＲＮＡ水平表达，从而诱导真性红细胞增多症骨髓单个核细胞凋亡。
关键词：活血祛瘀；药物诱导；Ｂｅｌ一２；ｐ５３基因；真性红细胞增多症；骨髓单个核细胞；细胞凋亡；基因调控
中图分类号：Ｒ５５５．１；Ｒ２８５．６文献标识码：Ａ文章编号：１００３—９７８３（２００４）０３—０２０８—０４
ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＢｌｏｏｄ－—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＢｌｏｏｄ—·ｓｔａｓｉｓ－·ｒｅｍｏｖｉｎｇＴｈｅｒａｐｙｏｎＣｅｌｌＡｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｓｓｏ－
ｃｉａｔｅｄＧｅｎｅｉｎＰｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａＶｅｒａＹＡＮＧＨｏｎｇｙｏｎｇ，ＳＵＮＪｉｎｆａｎｇ，ＣＨＥＮＺｈｉｘｉｏｎｇ，ＺＨＡＯＺｈｅｎｐｉｎｇ，ＧＵＸｕｅｋｕｉ，ＬＩＵａｎｐｉｎｇ（１．ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｍｌｉ—
ａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴＣＭ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０４０５；２．ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴＣＭ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
５１０４０５；３．ＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｕｎｉｃｉｐａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴＣＭ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０１３０）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｌｏｏｄ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄｂｌｏｏｄ—ｓｔａｓｉｓ—ｒｅｍｏｖｉｎｇ（ＢＡＢＡＲ）
ｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｐｏｌｙｅｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ（ＰＶ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｅｎｆｉｒｓｔ—ｖｉｓｉｔｏｒｔｉｎ—ｒｅｌｉｅｖｅｄｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄ
ｗｉｔｈＢＡＢＡＲｔｈｅｒａｐｙｆｏｒ１２ｗｅｅｋｓ．Ｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓｓｅｒｖｅｄａｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒ０１．Ｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄ１，４，８ａｎｄ１２
ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｏｆｂｏｎｅｍａｌｌｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＢＭＭＣ）ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅＴＵＮＥＬｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｃｌ一２ａｎｄｐ５３ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｔｈｅｉｒｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓ—ｓｉｏｎｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｉｎｓｉｔｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＯｎｅ，ｆｏｕｒａｎｄｅｉｇｈｔｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｏｆ
ＢＭＭＣｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅ１２ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｉｄ
ｎｏｔｄｉｆｆｅｒｆｒｏｍｔｈａｔ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＞０．０５）．ＴｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＢｅｌ一２ａｎｄｐ５３ａｎｄｔｈｅｉｒＲＮＡｅｘ．ｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０５）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ
ｐ５３ｇｅｎｅａｎｄｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆｂｃｌ一２ａｎｄｐ５３４ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）．
Ｓｏｄｉｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｂｃｌ一２ｇｅｎｅａｎｄｐ５３ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＢＡＢＡＲｉｎｔｒｅａｔｉｎｇＰＶａｒｒｉｖｅｄｔｈｅｐｅａｋ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｗｉｌｌｂｅｍｉｌｄ．ＩｔｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃｌ一２ａｎｄｐ５３ａｎｄｔｈｅｉｒｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃａｎｉｎ—ｄｕｃｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＢＭＭＣｉｎＰＶｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｌｏｏｄ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄｂｌｏｏｄ—ｓｔａｓｉｓ—ｒｅｍｏｖｉｎｇｔｈｅｒａｐｙ；Ｄｒｕｇｉｎｄｕｃｅ；Ｂｃｌ一２；ｐ５３；Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ；Ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
真性红细胞增多症（常简称真红）是一种造血于
细胞获得性恶性克隆性增生所致的疾病，以血细胞增
多导致全血容量增多，血液粘稠度增高症候群为临床特征，属骨髓增生性疾患之一。西医治疗本病主要采
用化疗或结合放血疗法，疗效尚可，但毒副作用明显。目前，中医治疗真性红细胞增多症主要采用活血
收稿日期：２００４一Ｏｌ一１５作者简介：杨洪涌（１９６２一），男，副教授，主要从事中医和中西医结合治疗血液病的研究。
基金项目：国家中医药管理局科研基金资助项目（编号００一ｊ—Ｐ一６９）。
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祛瘀法为基础，结合辨证加用养阴、清热、益气等
法，取得明显效果，其疗效已得到国内血液学界公认¨，１；但活血祛瘀法对该病的疗效机理则鲜见报道。
本研究试图从细胞凋亡及其相关基因角度探讨这一机
理。现将初步观察结果报告如下。·２０９·
１临床资料
１．１一般资料本组病人１０例，其中男６例，女４
例；年龄３５—７５岁，平均６１．３８岁。
１．２诊断标准参照张之南主编《血液病诊断与疗效标准》中真性红细胞增多症的诊断标准【４】。
１．３纳人标准符合诊断标准；未曾接受化疗，或已停用化疗１个月以上，能配合服用中药治疗及复查者。
１．４排除标准不符合纳入标准者；不能配合治疗、
复查者；继发性或相对性红细胞增多症；孕妇或合并有严重心肝肾功能损害者。
１．５疗效标准参照张之南主编《血液病诊断与疗效
标准》中真性红细胞增多症的国内疗效标准¨１：完全缓解，临床症状消失，皮肤、粘膜从红紫恢复到正
常，原肿大的肝脾显著回缩，血红蛋白恢复正常，白
细胞和血小板计数降至正常。若红细胞容量也恢复正
常，则称完全缓解。临床缓解，Ｉ临床及血象恢复如
上，但未测红细胞容量或测红细胞容量尚未恢复正
常。好转，临床症状明显改善，皮肤、粘膜红紫有所
减轻，原肿大的肝脾有所回缩，血红蛋白下降３０９／Ｌ以上。无效，临床症状、体征以及血象无变化或改善不明显。
２材料与方法
２．１仪器与试剂流式细胞仪（型号ＥＰＩＣＳＡＬ．ＴＲＡ），美国Ｃｏｕｌｔｅｒ公司产；Ｂｃｌ一２或ｐ５３免疫组化
染色超敏试剂盒［含过氧化物酶阻断溶液（ＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＢｌｏｃｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ），ＵｌｔｒｏＶｂｌｏｃｋ，即用型生物素标记的羊抗鼠抗体（ＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄＧｏａｔａｎｔｉ—Ｍｏｕｓｅ），链亲和素一过氧化物酶溶液（Ｓｔｒｐｔａｖｉｄｉｎ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ），一抗（ＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ）即鼠抗人Ｂｃｌ一２或ｐ５３、人Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ、ｐ５３ｍＲＮＡ及Ｆａｓ
ｍＲＮＡ原位杂交检测试剂盒、二氨基联苯氨（ＤＡＢ）显
色试剂盒、原位杂交专用盖玻片、焦碳酸二乙酯
（ＤＥＰＣ）均购自武汉博士德生物工程有限公司；多
聚左旋赖氨酸，Ｓｉｇｍａ公司出品；淋巴细胞分层液购自福建迈新生物工程公司；多聚甲醛、柠檬酸、丙
酮、磷酸二氢钠、氯化钠、精蛋白胰岛素一核糖核酸
酶Ａ溶液等试剂购自广州化学试剂公司。２．２分组及给药２．２．１治疗组给予活血祛瘀中药汤剂（桃仁１５９，
红花１５ｇ，赤芍１５ｇ，地龙１５ｇ，川牛膝２０ｇ，莪
术１５ｇ等），每日１剂，加水８００ｍＬ，煎成３００
ｍＬ，分两次温服；并予本院制剂消瘀灵丸（由《金
匮》大黄廑虫丸改制而成，具有活血祛瘀之功），
每次４～６ｇ，每日３次。服药期间不用任何有效西药。
２．２．２正常对照组为本校健康在校研究生志愿者，
不给予任何药物干预。
２．３ＴＵＮＥＬ法检测骨髓单个核细胞（ＰＭＮｃ）凋亡２．３．１单个核细胞分离取淋巴细胞分层液４ｍＬ置
人干燥离心管中，用吸管吸取抗凝骨髓液２ｍＬ，在
距离分层液上１ｃｍ处徐徐沿管壁加入，使淋巴细胞
分层液叠于骨髓液上。３０００ｒ／ｍｉｎ离心，２０～２５
ｍｉｎ，离心后绝大多数ＰＭＮＣ悬浮于血浆与淋巴细胞
分层液之间，用吸管吸出ＰＭＮＣ，移人另一干燥离心
管中，加入５倍以上体积ＰＢＳ，１０００ｒ／ｍｉｎ离心，
５～１０ｍｉｎ×３次，在显微镜下计数，制成１×１０６／Ｌ的单个核细胞悬液。
２．３．２细胞固定ＰＭＮＣ悬液加入１％多聚甲醛冰
浴１５ｍｉｎ，以３０００ｒ／ｍｉｎ×５ｍｉｎ离心，弃上清，用
ＰＢＳ洗两次，制成０．５ｍＬ的ＰＢＳ细胞悬液，试管中
加入５ｍＬ冷７０％乙醇，再加入０．５ｍＬ的细胞悬
液，冰浴放２４ｈ，再进行细胞凋亡的检测。
２．３．３细胞凋亡检测取１×１０６／ＬＰＭＮＣ悬液，置
１５００ｒ／ｍｉｎ×８ｍｉｎ离心，弃乙醇。加１ｍＬＷａｓｈ缓
冲液，洗两次。加ＤＮＡ标记液５０斗Ｌ，混匀，正常对照组省去该步骤。３７℃温浴６０ｍｉｎ，每１５ｒａｉｎ摇
匀１次。各管加１ｍＬＲｉｎｓｅ缓冲液，１５００ｒ／ｍｉｎ×５ｍｉｎ离心，弃上清，洗两次。加入０．５ｍＬＰＩ／Ｒｎａｓｅ
ＡＳｏｌｕｔｉｏｎ（精蛋白胰岛素／核糖核酸酶Ａ溶液）。室温避光反应３０ｍｉｎ，３ｈ内上机检测。
２．４Ｂｃｌ一２、ｐ５３免疫组化检测２．４．１细胞涂片的制作将分离到的ＰＭＮＣ用ＰＢＳ
稀释，调整细胞浓度为１０６／ｍＬ，均匀涂片，室温晾
干，４℃丙酮固定１０ｍｉｎ，置４℃冰箱保存。
２．４．２免疫组织化学染色检测Ｂｃｌ一２，ｐ５３涂片用
