何首乌对Alzheimer病大鼠学习记忆及乙酰胆碱酯酶的作用_周琳
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AchE活力 = (测定管 O D值 - 测定空白管 O D 值 ) /(标准管 O D值 - 标准空白管 OD值 )。 ×标准 管浓度×蛋白含量
1. 2. 6 统计学处理 各 组数据均以 i± s 表 示 ,组间两两比较采用单因素方差分析和 q检验。
2 结 果 2. 1 大鼠学习记忆能力测试结果 测试结果 见表 1。术前各组学习能力基本一致。结果表明模型 组大鼠主动逃避电击次数明显多于两个对照组 ,且 随时间推移 ,所需电击次数反而增加 ,说明该组大鼠 学习记忆获得能力明显下降。治疗组在术后 5d与模 型 组无明显差异 ( P> 0. 05) ,但在 10d 后开始有差 异 ( P < 0. 01) ,且至术后 20d 时学习记忆获得能力 有明显提高 ,但与对照组仍有差异 ( P < 0. 01)。 结果 也显示 ,假手术组与生理盐水对照组之间无显著差 异 ( P> 0. 05)。
1. 2. 2 Aβ 孵育 用无菌生理盐水将 Aβ 稀 1-40 释成 10μg /μl, 37℃下孵育 1周 , 使其变为聚集状的 Aβ [7 ]。
1. 2. 3 动物模型的制作 Y型电迷宫测试后 48h, SD大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛 ( 0. 35g /kg )麻 醉动物 ,然后固定于脑立体定位仪 上 ,剪去局部 毛 发 ,消毒后切开皮肤 ,分开筋膜后按脑立体定位仪图 谱 , 于前囟后 3. 0mm ,中 线右侧 2. 0mm 处钻开 颅 骨 ,切开硬脑膜后 ,用微量注射器自脑表面垂直缓慢 进针约 2. 9mm (控制注射速度 0. 2μl /min) , 注射聚 集状 Aβ 溶 1-40 液 1μl,留针 5mi n以保证溶液充分 弥 散 ,然后缓慢撤针。 对照组只注射等量生理盐水 ,余 操作同上。假手术组仅切开皮肤不注射任何溶液 ,然 后缝合皮肤。 何首乌治疗组手术苏醒后即灌胃 1∶ 1 何首乌硫浸膏 25g /( kg· d) , 模型组、对照组、假手 术组灌胃等量的生理盐水。
Key words: Radix Polyg o ns M ultiflo rs Pr epar ata ( PM EG ); Alzheimer’ s disea se; Rat model; β -amy loid peptide; Acety lcho linester ase
Al zheimer病 ( AD)的神经病理引起特异性组织 学变化 ,绝大多数病例中 ,大量老年斑遍布大脑皮层 和许多脑深部核团。 从分散的深层核团伸向大脑皮 层的许多系统中 ,胆碱能、去甲肾上腺能、 5-羟色胺 能系统均表现异常 ,与递质有关的酶、代谢产物普遍 降低。这些异常中 ,有证据显示胆碱能系统异常也许 与 AD的痴呆特征关系最为密切 ,许多报告都证实 胆碱能异常在 A D中的重要意义 [1～ 3 ]。 生化方面表
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实验动物 雄性 SD大鼠 40只 , 月龄
2. 5月 , 体重 200～ 250g ,由中南大学湘雅 医院实验 动物中心提供。
1. 1. 2 主要试剂 Aβ1-40 (美国 sig ma 公司 ) , Ach E测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所 ) , 1∶ 1 何首乌硫浸膏 (湖南中医学院药学院制剂室制备 )。
组别
样本数
模型组
12
治疗组
12
假手术组
5
生理盐水对照组
5
表 1 各组大鼠迷宫学习记忆测试的结果 (单位: 次 )
获得记忆尝试次数
术前
术后 5d
10d
15d
14. 0± 2. 8 13. 8± 2. 6 14. 1± 2. 5 13. 9± 2. 4
25. 9± 7. 8 23. 8± 7. 2 11. 5± 2. 5 11. 4± 2. 7
26. 2± 8. 4 21. 5± 6. 9* 10. 8± 1. 8 11. 2± 1. 5
26. 9± 6. 9 17. 2± 4. 5* 10. 5± 1. 5 10. 8± 1. 3
治疗组与假手术组、生理盐水对照组及模型组比较 ,* P 均 < 0. 01
20d
27. 8± 7. 5 14. 2± 2. 9* 10. 5± 1. 5 10. 6± 1. 8
Abstract: Objective To inv estig ate whether a myloid-beta pro tein injec ted into hippocampus might affect memo ry ability a nd a ctivity o f acety lcho linester ase in r ats, a nd th e effects of Radix Polyg o num M ultiflor um Th umb ( PM T) . Methods The AD rat model w as esta blished by injection o f a myloid-beta pro tein ( Aβ 1-40, 10μg ) into righ t hippocampus of r ats. Lear ning and memo r y ability , the brain ace tylcho lineste rase activity w er e studied. Possible pro tectiv e effects of Radix Po lyg oni M ultiflo ri Prepara ta we re also observ ed. Results Lear ning and m emor y disor der agg rav ated pro gr essiv ely in ex perimental g ro up and amelio rated. O bvio usly in PM EG-administra ted g ro up at the 20th day. Ach E a ctivity in hippocam pus, M ey nert nucleus and cor tex y in ex perimental gr oup, a nd that in PM EG-administ rated g ro up r educed obv iously than in co ntro l g r oup, but hig her than in ex pe rimental g ro up. Conclusion PM EG show es go od activity , and ca n improv e the activity of AchE.
1. 1. 3 主要仪器设备 Y型电迷宫 (中南大学 湘雅医学院行为研究室 ) , N ARISHIGE立体定位仪 (日本产 SN-3型 ) , 1μl 微量注射器 (上海 精密仪器 厂 ) , cole-po rmer超声匀浆器、 UV-1601紫外可见光 分光光度计 ( shima DZU)。
2. 2 各组大鼠不同脑区 Ach E活性比较 测 试 结果见 表 2。 表 中显示 治疗组 大鼠不 同脑区 脑 AchE活性均显著高于模型组相应脑区 ( P < 0. 01) , 但显著低于假手术组和对照组 ( P < 0. 01) , Ach E活 性以基底前脑区最高 ,额叶最低。假手术组与生理盐 水对照组之间无显著差异 ( P> 0. 05)。
1. 2. 5 脑胆碱能系功能测定 各组动物于术 后 21d腹腔注射 10% 水合氯醛 ( 0. 35g /kg ) 以断髓 法处死大鼠后 ,迅速将脑取出 ,在冰床上操作 ,分离 出右脑皮层 ,从额极向后 3m m 取出额叶 ,枕极向前 3mm ,脑正中裂旁开 3m m 分离出海马、基底前脑均 稀释 ( 1∶ 10悬浮缓冲液 ) , 立即超声匀浆 ,取上清 , 备检 Ach E(按南京建成生物工程研究所提供的试剂 及方法操作 )。
现 为皮质和海马中的乙酰胆碱酯酶 ( AchE)和乙酰 胆碱转移酶 ( Ch AT )水平下降。 何首乌作为主药在 治疗脑功能障碍方面取得了较好的疗效 [ 4]。 实验拟 针 对 AD 的神经组 织学变化 , 根据“β -淀 粉样蛋 白 ( Aβ )毒性说” [ 5 ]建立 AD 模型 ,从 Ach E活性角度探 讨何首乌的作用机制。
· 394·
J A popl ex y and N ervous Di seas es, O ctob er 2004, V ol 21, N o. 5
文章编号: 1003-2754( 2004) 05-0394-03
何首乌对 Alzheimer病大鼠学习记忆 及乙酰胆碱酯酶的作用
周 琳 1 , 杨期东1 , 马志健 2 , 袁梦石3 , 候德仁 1 , 谭兴林 1 , 杜小平 1
关键词: 何首乌 ; Alzheim er病 ; 动物模型 ; β -淀粉样肽 ; 乙酰胆碱酯酶 中图分类号: R749. 1+ 6; R285. 5 文献标识码: A
The eff cet of PMEG on learning and memory ability and activity of AchE in AD rat Z HOU L in, Y AN G Qi-dong , MA Zhi-jian ,et al. ( Department of N eurology , X iangya Hospital ,Central South University ,Changsha 410008, Chi na )
中风与神经疾病杂志 2004年 10月 第 21卷 第 5期
· 395·
后 ,先将大鼠放入迷宫箱中 [6 ] , 适应 5mi n, 使其对 3 臂均探索进入 ,然后从 I臂开始随机次序变换测试 , 给电压 30～ 70V,电流 0. 5～ 0. 7m,延迟时间 5s。 电 击后大鼠逃避至安全区为正确反应 ,否则为错误反 应。每测 1次休息 30s,测 10次休息 5min。大鼠学习 记忆成绩以连续 10次测试中有 9次 ( 9 /10)正确反 应时 ,所需电击数表示。测试在上午进行 ,连续 30次 未跑正确者被淘汰 (共淘汰 4只 )。 再将动物随机分 为对照组 5只 ,假手术组 5只 ,模型组 13只和治疗 组 13只 (手术后各 1只大鼠未苏醒死亡 )。
1. 2. 6 统计学处理 各 组数据均以 i± s 表 示 ,组间两两比较采用单因素方差分析和 q检验。
2 结 果 2. 1 大鼠学习记忆能力测试结果 测试结果 见表 1。术前各组学习能力基本一致。结果表明模型 组大鼠主动逃避电击次数明显多于两个对照组 ,且 随时间推移 ,所需电击次数反而增加 ,说明该组大鼠 学习记忆获得能力明显下降。治疗组在术后 5d与模 型 组无明显差异 ( P> 0. 05) ,但在 10d 后开始有差 异 ( P < 0. 01) ,且至术后 20d 时学习记忆获得能力 有明显提高 ,但与对照组仍有差异 ( P < 0. 01)。 结果 也显示 ,假手术组与生理盐水对照组之间无显著差 异 ( P> 0. 05)。
1. 2. 2 Aβ 孵育 用无菌生理盐水将 Aβ 稀 1-40 释成 10μg /μl, 37℃下孵育 1周 , 使其变为聚集状的 Aβ [7 ]。
1. 2. 3 动物模型的制作 Y型电迷宫测试后 48h, SD大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛 ( 0. 35g /kg )麻 醉动物 ,然后固定于脑立体定位仪 上 ,剪去局部 毛 发 ,消毒后切开皮肤 ,分开筋膜后按脑立体定位仪图 谱 , 于前囟后 3. 0mm ,中 线右侧 2. 0mm 处钻开 颅 骨 ,切开硬脑膜后 ,用微量注射器自脑表面垂直缓慢 进针约 2. 9mm (控制注射速度 0. 2μl /min) , 注射聚 集状 Aβ 溶 1-40 液 1μl,留针 5mi n以保证溶液充分 弥 散 ,然后缓慢撤针。 对照组只注射等量生理盐水 ,余 操作同上。假手术组仅切开皮肤不注射任何溶液 ,然 后缝合皮肤。 何首乌治疗组手术苏醒后即灌胃 1∶ 1 何首乌硫浸膏 25g /( kg· d) , 模型组、对照组、假手 术组灌胃等量的生理盐水。
Key words: Radix Polyg o ns M ultiflo rs Pr epar ata ( PM EG ); Alzheimer’ s disea se; Rat model; β -amy loid peptide; Acety lcho linester ase
Al zheimer病 ( AD)的神经病理引起特异性组织 学变化 ,绝大多数病例中 ,大量老年斑遍布大脑皮层 和许多脑深部核团。 从分散的深层核团伸向大脑皮 层的许多系统中 ,胆碱能、去甲肾上腺能、 5-羟色胺 能系统均表现异常 ,与递质有关的酶、代谢产物普遍 降低。这些异常中 ,有证据显示胆碱能系统异常也许 与 AD的痴呆特征关系最为密切 ,许多报告都证实 胆碱能异常在 A D中的重要意义 [1～ 3 ]。 生化方面表
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实验动物 雄性 SD大鼠 40只 , 月龄
2. 5月 , 体重 200～ 250g ,由中南大学湘雅 医院实验 动物中心提供。
1. 1. 2 主要试剂 Aβ1-40 (美国 sig ma 公司 ) , Ach E测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所 ) , 1∶ 1 何首乌硫浸膏 (湖南中医学院药学院制剂室制备 )。
组别
样本数
模型组
12
治疗组
12
假手术组
5
生理盐水对照组
5
表 1 各组大鼠迷宫学习记忆测试的结果 (单位: 次 )
获得记忆尝试次数
术前
术后 5d
10d
15d
14. 0± 2. 8 13. 8± 2. 6 14. 1± 2. 5 13. 9± 2. 4
25. 9± 7. 8 23. 8± 7. 2 11. 5± 2. 5 11. 4± 2. 7
26. 2± 8. 4 21. 5± 6. 9* 10. 8± 1. 8 11. 2± 1. 5
26. 9± 6. 9 17. 2± 4. 5* 10. 5± 1. 5 10. 8± 1. 3
治疗组与假手术组、生理盐水对照组及模型组比较 ,* P 均 < 0. 01
20d
27. 8± 7. 5 14. 2± 2. 9* 10. 5± 1. 5 10. 6± 1. 8
Abstract: Objective To inv estig ate whether a myloid-beta pro tein injec ted into hippocampus might affect memo ry ability a nd a ctivity o f acety lcho linester ase in r ats, a nd th e effects of Radix Polyg o num M ultiflor um Th umb ( PM T) . Methods The AD rat model w as esta blished by injection o f a myloid-beta pro tein ( Aβ 1-40, 10μg ) into righ t hippocampus of r ats. Lear ning and memo r y ability , the brain ace tylcho lineste rase activity w er e studied. Possible pro tectiv e effects of Radix Po lyg oni M ultiflo ri Prepara ta we re also observ ed. Results Lear ning and m emor y disor der agg rav ated pro gr essiv ely in ex perimental g ro up and amelio rated. O bvio usly in PM EG-administra ted g ro up at the 20th day. Ach E a ctivity in hippocam pus, M ey nert nucleus and cor tex y in ex perimental gr oup, a nd that in PM EG-administ rated g ro up r educed obv iously than in co ntro l g r oup, but hig her than in ex pe rimental g ro up. Conclusion PM EG show es go od activity , and ca n improv e the activity of AchE.
1. 1. 3 主要仪器设备 Y型电迷宫 (中南大学 湘雅医学院行为研究室 ) , N ARISHIGE立体定位仪 (日本产 SN-3型 ) , 1μl 微量注射器 (上海 精密仪器 厂 ) , cole-po rmer超声匀浆器、 UV-1601紫外可见光 分光光度计 ( shima DZU)。
2. 2 各组大鼠不同脑区 Ach E活性比较 测 试 结果见 表 2。 表 中显示 治疗组 大鼠不 同脑区 脑 AchE活性均显著高于模型组相应脑区 ( P < 0. 01) , 但显著低于假手术组和对照组 ( P < 0. 01) , Ach E活 性以基底前脑区最高 ,额叶最低。假手术组与生理盐 水对照组之间无显著差异 ( P> 0. 05)。
1. 2. 5 脑胆碱能系功能测定 各组动物于术 后 21d腹腔注射 10% 水合氯醛 ( 0. 35g /kg ) 以断髓 法处死大鼠后 ,迅速将脑取出 ,在冰床上操作 ,分离 出右脑皮层 ,从额极向后 3m m 取出额叶 ,枕极向前 3mm ,脑正中裂旁开 3m m 分离出海马、基底前脑均 稀释 ( 1∶ 10悬浮缓冲液 ) , 立即超声匀浆 ,取上清 , 备检 Ach E(按南京建成生物工程研究所提供的试剂 及方法操作 )。
现 为皮质和海马中的乙酰胆碱酯酶 ( AchE)和乙酰 胆碱转移酶 ( Ch AT )水平下降。 何首乌作为主药在 治疗脑功能障碍方面取得了较好的疗效 [ 4]。 实验拟 针 对 AD 的神经组 织学变化 , 根据“β -淀 粉样蛋 白 ( Aβ )毒性说” [ 5 ]建立 AD 模型 ,从 Ach E活性角度探 讨何首乌的作用机制。
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J A popl ex y and N ervous Di seas es, O ctob er 2004, V ol 21, N o. 5
文章编号: 1003-2754( 2004) 05-0394-03
何首乌对 Alzheimer病大鼠学习记忆 及乙酰胆碱酯酶的作用
周 琳 1 , 杨期东1 , 马志健 2 , 袁梦石3 , 候德仁 1 , 谭兴林 1 , 杜小平 1
关键词: 何首乌 ; Alzheim er病 ; 动物模型 ; β -淀粉样肽 ; 乙酰胆碱酯酶 中图分类号: R749. 1+ 6; R285. 5 文献标识码: A
The eff cet of PMEG on learning and memory ability and activity of AchE in AD rat Z HOU L in, Y AN G Qi-dong , MA Zhi-jian ,et al. ( Department of N eurology , X iangya Hospital ,Central South University ,Changsha 410008, Chi na )
中风与神经疾病杂志 2004年 10月 第 21卷 第 5期
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后 ,先将大鼠放入迷宫箱中 [6 ] , 适应 5mi n, 使其对 3 臂均探索进入 ,然后从 I臂开始随机次序变换测试 , 给电压 30～ 70V,电流 0. 5～ 0. 7m,延迟时间 5s。 电 击后大鼠逃避至安全区为正确反应 ,否则为错误反 应。每测 1次休息 30s,测 10次休息 5min。大鼠学习 记忆成绩以连续 10次测试中有 9次 ( 9 /10)正确反 应时 ,所需电击数表示。测试在上午进行 ,连续 30次 未跑正确者被淘汰 (共淘汰 4只 )。 再将动物随机分 为对照组 5只 ,假手术组 5只 ,模型组 13只和治疗 组 13只 (手术后各 1只大鼠未苏醒死亡 )。
