基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体
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关 键 词 ：白 蛋 白 启 动 子 ；大 鼠 尿 激 酶 ；桡 足 类 绿 色 荧 光 蛋 白 ；四 环 素 调 控 系 统 ；慢 病 毒 载 体
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５８．９１；Ｑ７８９
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７５０３８（２０１９）０８００２９０５
肝脏相关 疾 病 （如 病 毒 性 肝 炎、肝 纤 维 化、肝 硬 化和肝癌等）严重危害人 类 健 康 。 ［１］ 迄 今，肝 脏 人 源 化的小鼠模型在肝脏疾病相关研究和新药筛选中具 有重要的应用价值 。 ［１３］ 与小 鼠 相 比，大 鼠 在 生 物 学 的许多方面与 人 类 更 为 相 近，是 更 理 想 的 多 种 人 类 疾病的动物模 型；其 次，大 鼠 体 型 较 大，利 于 手 术 操 作，同时其生 理 学 特 征 易 于 研 究。 创 制 肝 脏 人 源 化 大鼠模型的先决条件是建立肝损伤的大鼠模型和建 立免疫缺陷的 大 鼠 模 型，两 者 交 配 获 得 免 疫 缺 陷 和 肝损伤的大鼠 模 型。 研 究 发 现，尿 激 酶 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 激 活 剂 （ｕｒｏｋｉｎａｓｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｕＰＡ） 转基 因 于 ＡｌｂｕＰＡ 转 基 因 小 鼠 肝 脏 上 特 异 性 过 表 达，会造成小鼠肝脏损伤；移植鼠成熟 肝 细胞能 够有 效 在 受 损 的 ＡｌｂｕＰＡ 小 鼠 肝 脏 上 重 构 小 鼠 肝 脏 。 ［４６］ 人成 熟 肝 细 胞 移 植 入 ＳＣＩＤ／ＡｌｂｕＰＡ 免 疫 缺陷和肝损伤 的 小 鼠 模 型 体 内 后，在 受 损 的 小 鼠 肝
摘 要：基 于 四 环 素 调 控 系 统 构 建 白 蛋 白 （ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｌｂ）启 动 子 调 控 大 鼠 ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅｔｙｐｅｐｌａｓ ｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｒｕＰＡ）转基因肝特异性过表达的慢 病毒载体 ｐＬＶＸＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥｒｕＰＡＴ２ＡＣｏｐＧ ＦＰ（ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ）。以 ＣＴＧ０８７５２１１质粒为模 板，ＰＣＲ 扩 增 大 鼠 的 ｕＰＡ（ｒｕＰＡ）基 因，３＇端 添 加 Ｆｌａｇ 标 签，ＩｎＦｕｓｉｏｎ克隆至 ｐＬＶＸＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥＴ２ＡＣｏｐＧＦＰ（ｐＬＡＴＴＴＧ）质 粒 中，得 到 慢 病 毒 载 体 ｐＬＶＸ ＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥｒｕＰＡＴ２ＡＣｏｐＧＦＰ（ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ），所构建质粒经测序和酶切鉴定。将 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ 瞬 时转染２９３Ｔ 细胞，转染后２４ｈ倒置荧光显微镜检测 ＣｏｐＧＦＰ 表达；接着向６孔细胞培养板内加入强力霉 素（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘ），４８ｈ后在倒置荧光显微镜下观察 ＣｏｐＧＦＰ 表达（包括未加 Ｄｏｘ的孔），随 后收集细 胞 以提取总 ＲＮＡ 和总蛋白，用于 ＲＴｑＰＣＲ 检测ｒｕＰＡ 及报告基因表达和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测标签蛋白 Ｆｌａｇ表 达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载 体 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ；瞬 转 ２９３Ｔ 细 胞 后，２４ｈ 倒 置 荧 光 显 微 镜 下可见零星细胞（约占０．１％）发弱的绿色荧光，加 Ｄｏｘ４８ｈ 后 所 有 细 胞 展 现 强 的 绿 色 荧 光，而 不 加 Ｄｏｘ 的 孔内仍然只见到零星细胞（约占０．１％）发弱的绿色荧光。ＲＴｑＰＣＲ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 结果 显示，与不加 Ｄｏｘ的细胞相比，加 Ｄｏｘ的细胞中ｒｕＰＡ、报告基因 ＣｏｐＧＦＰ 和 Ｆｌａｇ表达水平显著 升高。结果 提示，成功基 于四环素调控系统构建 Ａｌｂ启动子调控大鼠 ｕＰＡ 转 基 因 表达的慢 病 毒载 体 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ，为 相 关 后 续 实 验奠定了基础。
脏上成功重构 了 人 肝 脏，人 源 肝 细 胞 的 嵌 合 率 几 乎 达 到 １００％［７９］。ＡｌｂｕＰＡ 鼠 作 为 肝 损 伤 模 型 存 在 的不足是新生鼠死亡率非常高，繁殖非 常困难；肝细 胞移植手术需在 鼠 出 生 后 ２ 周 内 完 成，移 植 操 作 难 度非常大，死 亡 率 非 常 高 。 ［１３］ 四 环 素 调 控 系 统 （含 Ｔｅｔｏｎ系统和 Ｔｅｔｏｆｆ系统）是目前体内外应用最为 成功的基 因 表 达 调 控 系 统 之 一 。 ［１０１１］ 为 此，拟 综 合 利用 Ｔｅｔｏｎ 系 统 和 肝 脏 特 异 的 白 蛋 白 （Ａｌｂ）启 动 子，构建药物可诱导和肝特 异表达大 鼠 ｕＰＡ 转 基 因 的大鼠，以最终获 得 药 物（强 力 霉 素，Ｄｏｘ）可 控 的 肝 损伤大鼠模 型；该 肝 损 伤 模 型 借 助 Ｔｅｔｏｎ 系 统，可 通过 Ｄｏｘ加入诱 导 大 鼠 ｕＰＡ 转 基 因 于 肝 脏 特 异 表 达，以诱导大鼠 肝 损 伤。 此 药 物 可 控 的 肝 损 伤 大 鼠 模型与免疫缺 陷 大 鼠 交 配，可 获 得 免 疫 缺 陷 的 药 物 诱导型肝损伤动物模型，进而移植 人成 熟肝细 胞，有 望获得人源化 肝 脏 的 大 鼠 模 型。 目 前，慢 病 毒 载 体
收 稿 日 期 ：２０１８０７１１ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （８１６００４８８）；广 东 省 科 技 计 划 项 目 （２０１７Ａ０１０１０５０１７） 作 者 简 介 ：张 晟 （１９８３－ ），男 ，安 徽 人 ，硕 士 ，主 从 事 基 因 修 饰 动 物 的 研 发 。 通 讯 作 者
动 物 医 学 进 展 ，２０１９，４０（８）：２９３３ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
基于四环素调控系统构建白蛋白启动子 调控大鼠 ｕＰＡ 转基因表达的慢病毒载体
张 晟１，黎 海 燕３，廉 梅３，刘 宇３，肖 东２，３，林 晓 琳２
（１．南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室，广东广州 ５１０５１５；２．南方医科大学基础医学院肿瘤研究所，广东广州 ５１０５１５； ３．南方医科大学实验动物中心，广东广州 ５１０５１５）
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５８．９１；Ｑ７８９
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７５０３８（２０１９）０８００２９０５
肝脏相关 疾 病 （如 病 毒 性 肝 炎、肝 纤 维 化、肝 硬 化和肝癌等）严重危害人 类 健 康 。 ［１］ 迄 今，肝 脏 人 源 化的小鼠模型在肝脏疾病相关研究和新药筛选中具 有重要的应用价值 。 ［１３］ 与小 鼠 相 比，大 鼠 在 生 物 学 的许多方面与 人 类 更 为 相 近，是 更 理 想 的 多 种 人 类 疾病的动物模 型；其 次，大 鼠 体 型 较 大，利 于 手 术 操 作，同时其生 理 学 特 征 易 于 研 究。 创 制 肝 脏 人 源 化 大鼠模型的先决条件是建立肝损伤的大鼠模型和建 立免疫缺陷的 大 鼠 模 型，两 者 交 配 获 得 免 疫 缺 陷 和 肝损伤的大鼠 模 型。 研 究 发 现，尿 激 酶 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 激 活 剂 （ｕｒｏｋｉｎａｓｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｕＰＡ） 转基 因 于 ＡｌｂｕＰＡ 转 基 因 小 鼠 肝 脏 上 特 异 性 过 表 达，会造成小鼠肝脏损伤；移植鼠成熟 肝 细胞能 够有 效 在 受 损 的 ＡｌｂｕＰＡ 小 鼠 肝 脏 上 重 构 小 鼠 肝 脏 。 ［４６］ 人成 熟 肝 细 胞 移 植 入 ＳＣＩＤ／ＡｌｂｕＰＡ 免 疫 缺陷和肝损伤 的 小 鼠 模 型 体 内 后，在 受 损 的 小 鼠 肝
摘 要：基 于 四 环 素 调 控 系 统 构 建 白 蛋 白 （ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｌｂ）启 动 子 调 控 大 鼠 ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅｔｙｐｅｐｌａｓ ｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｒｕＰＡ）转基因肝特异性过表达的慢 病毒载体 ｐＬＶＸＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥｒｕＰＡＴ２ＡＣｏｐＧ ＦＰ（ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ）。以 ＣＴＧ０８７５２１１质粒为模 板，ＰＣＲ 扩 增 大 鼠 的 ｕＰＡ（ｒｕＰＡ）基 因，３＇端 添 加 Ｆｌａｇ 标 签，ＩｎＦｕｓｉｏｎ克隆至 ｐＬＶＸＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥＴ２ＡＣｏｐＧＦＰ（ｐＬＡＴＴＴＧ）质 粒 中，得 到 慢 病 毒 载 体 ｐＬＶＸ ＡｌｂＴｅｔＯｎｅＴＲＥｒｕＰＡＴ２ＡＣｏｐＧＦＰ（ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ），所构建质粒经测序和酶切鉴定。将 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ 瞬 时转染２９３Ｔ 细胞，转染后２４ｈ倒置荧光显微镜检测 ＣｏｐＧＦＰ 表达；接着向６孔细胞培养板内加入强力霉 素（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘ），４８ｈ后在倒置荧光显微镜下观察 ＣｏｐＧＦＰ 表达（包括未加 Ｄｏｘ的孔），随 后收集细 胞 以提取总 ＲＮＡ 和总蛋白，用于 ＲＴｑＰＣＲ 检测ｒｕＰＡ 及报告基因表达和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测标签蛋白 Ｆｌａｇ表 达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载 体 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ；瞬 转 ２９３Ｔ 细 胞 后，２４ｈ 倒 置 荧 光 显 微 镜 下可见零星细胞（约占０．１％）发弱的绿色荧光，加 Ｄｏｘ４８ｈ 后 所 有 细 胞 展 现 强 的 绿 色 荧 光，而 不 加 Ｄｏｘ 的 孔内仍然只见到零星细胞（约占０．１％）发弱的绿色荧光。ＲＴｑＰＣＲ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 结果 显示，与不加 Ｄｏｘ的细胞相比，加 Ｄｏｘ的细胞中ｒｕＰＡ、报告基因 ＣｏｐＧＦＰ 和 Ｆｌａｇ表达水平显著 升高。结果 提示，成功基 于四环素调控系统构建 Ａｌｂ启动子调控大鼠 ｕＰＡ 转 基 因 表达的慢 病 毒载 体 ｐＬＡＴＴＲＵＴＧ，为 相 关 后 续 实 验奠定了基础。
脏上成功重构 了 人 肝 脏，人 源 肝 细 胞 的 嵌 合 率 几 乎 达 到 １００％［７９］。ＡｌｂｕＰＡ 鼠 作 为 肝 损 伤 模 型 存 在 的不足是新生鼠死亡率非常高，繁殖非 常困难；肝细 胞移植手术需在 鼠 出 生 后 ２ 周 内 完 成，移 植 操 作 难 度非常大，死 亡 率 非 常 高 。 ［１３］ 四 环 素 调 控 系 统 （含 Ｔｅｔｏｎ系统和 Ｔｅｔｏｆｆ系统）是目前体内外应用最为 成功的基 因 表 达 调 控 系 统 之 一 。 ［１０１１］ 为 此，拟 综 合 利用 Ｔｅｔｏｎ 系 统 和 肝 脏 特 异 的 白 蛋 白 （Ａｌｂ）启 动 子，构建药物可诱导和肝特 异表达大 鼠 ｕＰＡ 转 基 因 的大鼠，以最终获 得 药 物（强 力 霉 素，Ｄｏｘ）可 控 的 肝 损伤大鼠模 型；该 肝 损 伤 模 型 借 助 Ｔｅｔｏｎ 系 统，可 通过 Ｄｏｘ加入诱 导 大 鼠 ｕＰＡ 转 基 因 于 肝 脏 特 异 表 达，以诱导大鼠 肝 损 伤。 此 药 物 可 控 的 肝 损 伤 大 鼠 模型与免疫缺 陷 大 鼠 交 配，可 获 得 免 疫 缺 陷 的 药 物 诱导型肝损伤动物模型，进而移植 人成 熟肝细 胞，有 望获得人源化 肝 脏 的 大 鼠 模 型。 目 前，慢 病 毒 载 体
收 稿 日 期 ：２０１８０７１１ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （８１６００４８８）；广 东 省 科 技 计 划 项 目 （２０１７Ａ０１０１０５０１７） 作 者 简 介 ：张 晟 （１９８３－ ），男 ，安 徽 人 ，硕 士 ，主 从 事 基 因 修 饰 动 物 的 研 发 。 通 讯 作 者
动 物 医 学 进 展 ，２０１９，４０（８）：２９３３ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
基于四环素调控系统构建白蛋白启动子 调控大鼠 ｕＰＡ 转基因表达的慢病毒载体
张 晟１，黎 海 燕３，廉 梅３，刘 宇３，肖 东２，３，林 晓 琳２
（１．南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室，广东广州 ５１０５１５；２．南方医科大学基础医学院肿瘤研究所，广东广州 ５１０５１５； ３．南方医科大学实验动物中心，广东广州 ５１０５１５）
