杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。

本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。

分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。

以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。

以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。

重组蛋白的鉴定
重组蛋白是指通过基因重组技术获得的蛋白质，获得后常常需要对其进行鉴定以保证其正确性。

百泰派克生物科技提供基于质谱技术的重组蛋白鉴定服务。

重组蛋白
重组蛋白是指通过基因重组技术获得的蛋白质。

用基因重组技术对基因进行修饰可导致突变蛋白的表达。

重组蛋白是天然蛋白的一种加工形式，通过多种方式产生，以增加蛋白质的产量、修改基因序列和制造有用的蛋白质商业产品。

重组蛋白是研究生物学过程的重要工具，且重组蛋白为生物医学技术提供了重要突破。

重组蛋白不仅可用于生物医学研究，还可用于治疗，如重组蛋白药物。

产生重组蛋白需要使用表达系统，合适的表达系统的选择取决于重组蛋白的特性和预期应用，并且选择合适的表达系统对于产生足够量的蛋白是必要的。

四种常用的表达系统包括大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母，杆状病毒/昆虫细胞和哺乳动物细胞。

大肠杆菌系统是表达重组蛋白质的快速方法，但缺乏真核生物中发现的许多翻译后修饰。

蛋白质谱鉴定示意图。

重组蛋白的鉴定
因为重组蛋白是人工对天然蛋白质的改造，所以在得到重组蛋白后常常需要对其进行鉴定，以保证重组蛋白的正确性。

重组蛋白的鉴定可以采用的方法包括电泳、层
析、测序、Western Blot和与质谱有关的方法等。

其中质谱法可以对重组蛋白的分子量、序列、翻译后修饰等进行测定，从而实现重组蛋白的鉴定。

重组蛋白工艺流程
重组蛋白工艺流程：
目标基因的扩增。

首先，需要设计引物，这些引物应避开目标蛋白的跨膜区和二级结构，如选择N端或C端的序列。

这些引物的设计结合了目标蛋白的结构信息和基因信息，并通过第三方公司合成。

插入克隆载体。

利用PCR技术，根据目标蛋白的特异表达组织，使用设计的引物进行PCR扩增，然后进行酶切和连接，将目的片段与载体结合。

亚克隆到表达载体中。

将连接好的目的片段转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，并进行挑菌验证，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确认目的片段是否成功插入载体。

蛋白表达。

在特定的条件下，如诱导剂的存在，将重组载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统，进行蛋白的表达。

蛋白的鉴定和纯化。

通过SDS-PAGE和western blot或荧光等方法进行蛋白的鉴定，由于载体中通常包含标签（如His标签），可以使用特定的纯化方法，如镍柱纯化，来分离和纯化重组蛋白。

质量检测和保存。

纯化后的蛋白会进行冻干处理，并进行常规的蛋白质实验验证其分子量和纯度，纯度通常需要超过95%。

通过测试后，蛋白会被储存。

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。

原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。

真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。

昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。

2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。

3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。

4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。

5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。

多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。

缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。

酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。

蛋白质量不理想。

哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。

成本高；表达水平低，技术和环境要求高。

昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。

重组蛋白糖基化程度低。

杆状病毒表达系统简介体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。

原核细胞系统主要是⼤肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益⼤及表达产物稳定，但是表达基因的相对分⼦质量有限，不宜过⼤，且不能对表达产物进⾏⼀些翻译后加⼯、修饰。

真核细胞系统包括CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆⾍细胞等。

昆⾍细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的⽣物学特性，⽇益受到⼈们的重视。

1、杆状病毒的⽣物学特性杆状病毒只来源于⽆脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进⾏分⼦⽣物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单⼀闭合环状双链DNA分⼦，⼤⼩为80～160 kb，其基因组可在昆⾍细胞核复制和转录。

DNA复制后组装在杆状病毒的核⾐内，后者具有较⼤的柔韧性，可容纳较⼤⽚段的外源DNA插⼊，因此是表达⼤⽚段DNA的理想载体。

其中，⽤作外源基因表达载体的杆状病毒，⽬前仅限于核型多⾓体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多⾓体蛋⽩包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多⾓体形状。

核型多⾓体病毒有两种形式：⼀种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另⼀种则为细胞外芽⽣病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的⾓⾊不同，包含体病毒是昆⾍间⽔平感染的病毒形式，昆⾍往往是⾷⼊污染OV的⾷物后引起感染。

包含体病毒外层裹了⼀层蛋⽩晶体，即为29 000的多⾓体蛋⽩，它对病毒的⽔平感染起以下作⽤：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏⽽失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆⾍中肠上⽪局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋⽩酶溶解多⾓体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽⽣出BV，进⼊⾎淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近⼏⼗年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深⼊的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多⾓体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

Sf-900II SFM中文说明书优化的无血清培养基生长的昆虫和其他无脊椎动物细胞系表达重组蛋白Cat.No.:10902500mL1000mL10L组成缺少培养基Cat.No.:21012500mL不含L-甲硫氨酸和L-胱氨酸可根据要求定制包装储存条件：2 8°C，在黑暗中签收后的最低保质期：2个月注：目录编号21012请同时参阅组成缺少媒介补充。

特点：草地夜蛾(Sf9,Sf21)、舞毒蛾(Ld)和粉纹夜蛾(Tn-368)高级生长细胞与市售的无血清和无血清培养基通过昆虫细胞培养系统生产重组蛋白质进行了优化(现有系统的2-10倍的增长)无蛋白质可扩展的各种生物反应器能够支持长期细胞生长的（大于20代）细胞适应其他市售的无血清培养基，可以直接在SF-900II SFM传代，通常不需要进一步的适应支持高产量的野生型AcNPV(occluded and non-occluded virus)说明Sf-900II SFM是支持多种昆虫细胞系细胞生长的增加，以及显着增加使用杆状病毒表达系统中生产重组蛋白的无蛋白培养基。

欲了解更多关于昆虫细胞表达、增长重组蛋白的信息，见参考文献3-8草地夜蛾细胞（sf9）在sf-900II SFM中生长至9~12*106个细胞/ml时，rβ-半乳糖苷酶的表达达到最大细胞密度高达50U/ml，显着改善了竞争对手的配方和原来的SF-900的配方（见参考文献1和图1）舞毒蛾和粉纹夜蛾细胞系也观察到最大细胞密度增加20％到100％。

BEVS最初由德克萨斯州A&M大学的Smiths等人研发的。

传统上，Summers 等人十三月添加10%胎牛血清的Grace’s TNM-FH昆虫细胞培养基用于BEVS技术。

到目前为止，超过200个重组（基因）蛋白使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒转染sf9细胞系成功表达。

Sf-900II SFM是为培养sf9和其他鳞翅目昆虫细胞系，生产昆虫病毒和rDNA蛋白而设计的，经改良不含血清的培养基。