杆状病毒表达系统及其应用进展

󰀁综述与专论󰀁生物技术通报

BIOTECHNOLOGY󰀂BULLETIN2010年第10期

杆状病毒表达系统及其应用进展

韦永龙󰀂李轶女󰀂张志芳󰀂沈桂芳

(中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)

󰀂󰀂摘󰀂要:󰀂杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优

点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的

改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转

移,RNA干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。

关键词:󰀂杆状病毒󰀂BEVS󰀂表达

AdvancesinResearchandApplicationof

BaculovirusExpressionSystem

WeiYonglong󰀂LiYinv󰀂ZhangZhifang󰀂ShenGuifang

(BiotechnologyResearchInstitute,CAAS,Beijing100081)

󰀂󰀂Abstrac:t󰀂Baculovirusesareobligatelethalpathogensofarthropodas.Theyhavebeenhighlyvaluedandwidelystudiedsincebe󰀁

ingexploitedasaexpressionvectorin1980s,fortheirexcellentadvantageincludingeukaryoticexpressionenviroment.Inlessthan30

years,greatadvanceshaveachievedinvolvingrecombinantbaculovirusconstructionandscreening.Thus,thebaculovirusexpressionvec󰀁

torsystem(BEVS)hasbecomeoneofthefourmostpopularexpressionsystemcomprisingbacterium,yeasts,mammaliancellsandbacu󰀁

loviruses.TheBEVShasbeenusedinsurfacedisplay,virus󰀁likeparticles production,mammaliancells genedelivery,RNAinterfer󰀁

ence,etc.ThedevelopmentandapplicationoftheBEVSisreviewedinthisarticle.

Keywords:󰀂Baculovirus󰀂BEVS󰀂Expression

收稿日期:2010󰀁04󰀁26基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863∀计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E󰀁mai:lweiyonglong@126󰀂com通讯作者:沈桂芳,教授,E󰀁mai:lgfsh2008@caas󰀂net󰀂cn杆状病毒是一种DNA双链病毒,基因组约

80-160kb之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄

生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒

所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1]。根

据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状

病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedrovirus,NPV)

和颗粒体病毒属(granulovirus,GV)[2]。杆状病毒表达

系统(baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS)是一

个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中

表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核

修饰环境,容量大,表达量高等特点,自SmithGE等于

1983年利用AcNPV成功表达外源蛋白以来,经过不到

30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物

细胞表达系统)之一。

杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接

载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移

载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个

或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启

动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将

重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着

病毒的复制的而获得表达。

1󰀂重组杆状病毒的构建和纯化

最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病

毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基

因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的生物技术通报Biotechnology󰀂Bulletin2010年第10期

细胞在显微镜下形成空斑,通过多次重复筛选,可以

对重组病毒进行纯化,但此过程费时费力,效率很

低,是杆状病毒应用中一个重要的限制因素。因此,

近年来开发了多种技术,大大优化了杆状病毒的构

建和筛选过程。

1.1󰀂杆状病毒的线性化

1990年,Kitts等[3]在AcMNPV的多角体蛋白

基因所在(polyhedrin)位置引入一个惟一的限制性

酶切位点(Bsu36I),使亲本病毒线性化,降低了野

生型病毒背景,使重组病毒的比率达到了25%以

上,提高了重组病毒的筛选效率,随后在杆状病毒

DNA中的必需基因orf1629外再加入一个Bsu36I

位点,Bsu36I酶切后orf1629失活,只能通过与携带

外源基因的转移载体重组,补齐这一个病毒结构基

因后方可复制,使重组率提高到了90%[4]。1998

年,吴祥甫[5]也在BmNPV中引入了Bsu36I,构建了

BmNPV的线性化重组系统。理论上,线性化病毒重

组的重组率能达到100%,但实际操作中,仍然存在

很大比率的假阳性。

1.2󰀂体外重组表达载体(Cre󰀁loxP系统)

利用传统的体内同源重组获得重组病毒,效率很

低,为了解决这一问题,1992年Perkman等[6]根据噬

菌体p1编码的Cre重组酶能够催化特异位点lox发

生酶促交换反应的原理,分别在杆状病毒体多角体基

因以及重组载体上引入了loxP位点。重组时,先将

载体酶切,线性化,然后与修饰过的杆状病毒及Cre

酶液混合,37#下温育约20min,再转染昆虫细胞,

借助空斑及载体携带的󰀁󰀁半乳糖甘酶活性,很容易

筛选得到重组病毒。改进反应的条件和反应物的比

率,尽管重组比率仍然不高,却能得到绝对数量较多

的重组病毒,所以此方法特别适于高通量表达真核生

物的cDNA文库,该系统的缺点是会产生多轮重组而

导致几个载体同时串联加载到杆状病毒上。

1.3󰀂酵母󰀁昆虫细胞穿梭质粒载体

Patel等构建了酵母-昆虫细胞穿梭质粒载体,

他们将啤酒酵母的自主复制序列(autonomouslyrep󰀁

licatingsequence,ARS)和有丝分裂着丝点功能相关

序列(centromericsequence,CNE)引入杆状病毒基

因组的多角体基因上,使杆状病毒能够在酵母体内进行复制,并能够和相应的转移载体发生重组。详细步骤:在AcMNPV多角体蛋白基因中分别插入

SUP4󰀁0,ARS,URA3及CEN序列,其中URA3和

SUP4󰀁0为筛选标记。转移载体中外源基因的两翼

分别为病毒序列,酵母ARS序列。在酵母细胞内,

病毒DNA与转移载体重组后,能够删除SUP4󰀁0基

因。由于缺少SUP4󰀁0的酵母对刀豆氨酸(Canava󰀁

nine)显示抗性,所以用含有刀豆氨酸的选择培养基,

即可筛选发生重组的酵母菌落,提取重组菌株的总

DNA,利用蔗糖密度梯度离心纯化杆状病毒DNA,转

染昆虫细胞,即得到表达外源蛋白的重组病毒。此方

法最快可以在10d内得到重组病毒,而且免除了烦

琐的空斑筛选,另外,此方法还能同时分离几个不同

的重组子,所以是一个快速而高效的重组筛选系统。

其缺点是需要利用蔗糖密度梯度超速离心来分离重

组的DNA,否则转染重复性不好。

1.4󰀂大肠杆菌󰀁昆虫细胞穿梭质粒载体系统(Bacto

Bac系统)

1993年,Luckow等[7]根据F因子载体的原理,

在杆状病毒基因组中引入了一个细菌复制子,构建

了一种新型杆状病毒穿梭载体,取baculovirus的字

头和plasmid的字尾命名为bacmid,此质粒既能在

大肠杆菌中复制,也能感染昆虫细胞。Bacmid中,

在多角体蛋白基因所位置加上attTn7位点,卡那霉

素抗性基因,以及作为筛选标记的LacZ基因,在大

肠杆菌中,利用辅助质粒携带的Tn7转座酶,bacmid

就能够与携带外源基因的转移载体发生特异位点重

组,通过转移载体携带的抗性基因,病毒发生重组后

破坏了LacZ基因而使其所在的细菌宿主不能形成

蓝斑,能够高效筛选出含有重组病毒细菌单克隆。

此法与传统方法相比,操作简单,耗时短,整个重组

病毒筛选过程都能够在细菌中完成,所以周期可以

缩短至7-10d,而且不易出现假阳性,因此是一个

便捷的系统。

值得一提的是,利用侵染性的二氨基庚二酸

(DAP)营养缺陷型的大肠杆菌作为bacmid的宿主,

携带重组bacmid的细菌,能够在耶尔森氏鼠疫杆菌

(Yersiniapseudotubercolusis)的辅助下,侵染Sf9细

胞,由于昆虫细胞及细胞培养基中缺少DAP,细菌

在Sf9细胞内裂解,释放病毒DNA,从而感染细

胞[8]。此过程省去了提取bacmid和转染步骤,更经22010年第10期韦永龙等:杆状病毒表达系统及其应用进展

济、高效。

1.5󰀂杆状病毒󰀁S2系统

2000年,Lee等[9]构建了杆状病毒󰀁S2系统,与

其他的系统不同,该系统的反应器是果蝇的S2细

胞。此系统中,杆状病毒的多角体基因启动子被果

蝇的热激蛋白70基因(hsp70)、肌动蛋白5c基因

(actin5c)和金属硫蛋白基因等启动子代替,和转移

载体重组后,它们能驱动外源基因的高水平表达。

表达的细胞比率高,几乎全部感染重组杆状病毒的

细胞都出现表达。其表达量远远高于其它的真核载

体系统。另外,该系统的最大优点是,病毒感染及表

达外源蛋白并不引起细胞的裂解,因此,它是一个非

常优越的杆状病毒表达系统。

1.6󰀂Gateway技术

Gateway克隆系统是美国Invitrogen公司开发的

一项新颖的克隆表达系统,该系统利用󰀂噬菌体位

点特异重组的原理,进行酶促反应而得到所需要的

重组病毒,其核心是两次重组反应:BP(attB∃attP)

和LR(attL∃attR)。通过第一个反应,可以将外源

基因片段(含有attB)整合到供体质粒(donorvector,

含有attP)上,得到入门载体(entryclone,含有attL)

上,第二个反应将入门载体上的外源基因转移到目

的载体(destinationvector,含有attR)上,得到表达载

体(expressionclone)[10]。反应的过程是将attR位

点引入杆状病毒基因组上并线性化得到得到Bacu󰀁

loDirectTM线性DNA,经改造过的杆状病毒基因组在

体外含有GatewayTMLRClonaseTM酶的反应体系中,

就能够与携带外源基因的入门克隆载体进行重组。