定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

如何提高FuGENE HD转染实验成功率FuGENE, 转染摘要：在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。

在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。

【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。

只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。

基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。

培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。

有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。

务必要使培养基避光保存。

因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。

酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。

胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。

采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。

因此血清易受显著生物学变异的影响。

添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。

CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。

用CO2是为了控制pH值。

细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。

有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。

需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。

如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。

来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究童夏生;孟哲峰【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2007(023)008【摘要】目的:建立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测.方法:利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后,提取病毒基因组DNA.以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒(bacmid)作为标准模板,进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线,然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果:成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝,病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/mL)值约为空斑检测的滴度pfu/mL值的10倍.结论:荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒,并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度,较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量.【总页数】4页(P1623-1626)【作者】童夏生;孟哲峰【作者单位】浙江省温岭市第三人民医院,浙江,温岭,317523;中国疾病控制预防中心,北京,100002【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究 [J], 沈波;孟哲峰;彭颖;吕建新2.荧光定量PCR技术用于模拟临床标本单增李斯特菌检测的研究 [J], 王艳;赵爱兰;叶长芸3.实时荧光定量PCR技术应用于核酸定量检测的研究进展及展望 [J], 任广睦;刘季;王英元4.表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究 [J], 华涛;陶丽红;葛金英;王喜军;沈向真;步志高5.表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury—LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。

2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。

抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。

实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。

2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。

b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。

c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。

3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。

4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。

加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。

5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。

27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。

二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。

即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。

2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。

长期保存分装冻存于-80℃。

3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。

病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。

它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。

正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。

下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。

一、细胞培养法。

细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。

首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。

接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。

二、血凝法。

血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。

这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。

首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。

根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。

三、动物接种法。

动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。

这种方法通常用于病毒毒力的测定。

通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。

总结。

以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。

在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。

希望本文对您有所帮助。

病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。

放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。

定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。

每孔细胞为5×104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl 的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。

在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。

然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。

用培养基吹洗下，离心收集细胞。

流式细胞术快速检测杆状病毒滴度徐鹏;张佑红;杨益;彭继明;陈龙;靖志强;危威;马静;秦琴【摘要】为了快速而准确的测定杆状病毒的滴度,采用流式细胞术对经SYBR Green I染色后的杆状病毒直接计数.考察固定、破膜和染色等因素对检测结果的影响,并验证改进后的方法的重复性和线性性.杆状病毒最佳染色条件:质量分数为0.1%的多聚甲醛固定病毒30 min后,加入一定量的SYBR Green I在80℃下孵育10 min.测量结果CV值为2.4%(n=8),R2为0.999 8.整个测量过程由原来终点稀释法的7～10 d缩短到1 h.【期刊名称】《武汉工程大学学报》【年(卷),期】2010(032)001【总页数】4页(P57-60)【关键词】流式细胞术;杆状病毒;SYBRGreenI【作者】徐鹏;张佑红;杨益;彭继明;陈龙;靖志强;危威;马静;秦琴【作者单位】武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074【正文语种】中文【中图分类】Q3310 引言杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system, BEVS)由于其表达的高效性、安全性等诸多优点，在重组蛋白生产、疫苗的研制以及生物杀虫剂等方面具有很高的应用前景[1].为了提高重组蛋白或病毒的产量，必须准确测定杆状病毒与细胞的浓度比，即感染复数(multiplicity of infection，MOI)[2-3].目前病毒滴度的测定方法主要是蚀斑法和终点稀释法(EPDA)[4-5]，两种方法都是利用病毒去感染细胞而间接得到病毒的滴度，测量过程繁琐，耗时长，且不同实验者之间测得的结果相差较大.随着近年来流式细胞术(FCM)的不断发展，其检测范围不再局限于细胞，它已广泛应用于生物医学的各个领域.Marie和Brussaard[6-7]等采用流式细胞仪通过特异性核酸荧光染料SYBR Green I染色成功地检测并计数海洋病毒.在此基础上，Shen[8]首次利用流式细胞术计数杆状病毒，但染色效果不好.本实验针对染色过程中的主要影响因素进行优化，验证了改进后方法的重复性和线性性，并对流式细胞术与终点稀释法的计数结果进行比较.1 实验部分1.1 病毒野生型的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wide type AcNPV)由武汉大学友好提供.1.2 试剂及仪器SYBR Green I(10 000×)和黄绿荧光微球(1μm)均购于Molecular Probes公司；多聚甲醛购于生工生物工程有限公司；Triton X-100购于Amresco公司；FACSCalibur流式细胞仪，BD公司生产.1.3 样品制备病毒样品制备的主要步骤可分为固定、破膜和染色.待测病毒经磷酸盐缓冲液(PBS，pH=8.0)稀释后，加入一定量的多聚甲醛4 ℃下固定30 min，再放入-80 ℃超低温冰箱15 min，然后置于室温水浴中5 min，加入一定量的Triton X-100室温放置5 min，最后加入SYBR Green I进行染色，具体的影响因素及水平如表1所示.在上机检测之前，加入已知浓度的黄绿荧光微球作为内参.表1 病毒染色过程的影响因素及水平Table1 Factors and levels of the baculovirus dyeing procedure因素水平多聚甲醛质量分数/%0.00, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40冻融处理不冻融, 一次, 两次Triton X-100质量分数/%0.00, 0.05, 0.10, 0.20孵育温度/℃25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90孵育时间/min0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 601.4 流式细胞仪分析采用BD公司FACSCalibur流式细胞仪检测病毒样品.前向散射光(FSC-H)、侧向散射光(SSC-H)和绿色荧光(FL1-H)均以对数模式获取.以FL1-H设定阈值，减少背景干扰.CellQuest软件分析数据，在SSC-H和FL1-H的双参数散点图上确定病毒和微球的位置(图1).图1 SSC-H vs. FL1-H双参数散点图Fig.1 Dot plots of side scatter vs. green fluorescence“门”R1内为加入的微球，“门”R2内为待测的病毒.根据R1/R2可以推算出样品病毒的滴度(1).(1)将得到的样品病毒滴度乘以稀释倍数便是原病毒样本中的病毒滴度.1.5 重复性和线性性检测线性性：PBS缓冲液稀释杆状病毒1000倍，取稀释后不同体积(5～640 μL)的病毒测定其滴度，做3个重复，计算相关系数R2.重复性：对同一个病毒样本计数8次，计算变异系数CV.1.6 流式细胞术与终点稀释法的计数结果比较为了比较改进后的流式测量方法与传统的病毒测定方法的准确性，采用终点稀释法[4]对同一病毒样本进行检测，具体如下：a.将处于对数生长期的Sf9细胞接种于96孔板中(100 μL/孔)，27 ℃下孵育24 h.b.以新鲜培养基连续10倍稀释杆状病毒(10-4～10-10).c.96孔板去上清，于每孔加入不同稀释度的病毒100 μL，每稀释度重复12孔，对照孔加入100 μL的新鲜培养基代替病毒液，27 ℃下孵育5～7 d.d.按Spearman-Karber法[9]计算病毒样本的TCID50值.重复测量5次，计算变异系数CV.2 结果与讨论2.1 固定的影响图2显示了不同质量分数的多聚甲醛固定对杆状病毒计数的影响.采用多聚甲醛固定能够维持病毒的原有形态，提高病毒的计数，但当其质量分数大于0.1%后病毒的计数随之减少.这主要是由于甲醛与DNA的相互作用，削弱了染料SYBR Green I与DNA的结合.病毒颗粒的荧光强度也会随着多聚甲醛质量分数的增加而降低. 图2 多聚甲醛固定的影响Fig.2 Effects of paraformaldehyde concentrations on baculovirus counts注: 规定未经固定处理的样本荧光强度为1.2.2 破膜处理破膜的主要原理是利用骤冷骤热或破膜剂的溶脂作用增强病毒颗粒的通透性，以便于染料的进入.从图3(a)可知，病毒样本经过冻融处理后，荧光强度逐渐增强，但病毒计数却随之而减少，这可能是由于冻融导致一部分病毒的DNA与染料不能有效地结合.图3(b)是Triton X-100终质量分数为0.2%的直方图，与图1相比较可知：经破膜剂处理后，病毒的荧光信号分散，背景噪音增强，导致两峰交叠，不利于病毒的准确计数.(a)冻融处理的影响(b)破膜剂处理的影响图3 破膜处理对病毒计数的影响Fig.3 Effects of permeabilization on baculovirus counts注: 规定未经冻融处理的样本荧光强度为1.2.3 染色温度和时间的影响孵育过程对病毒计数的影响显著(图4).孵育温度的提高，一方面可以使病毒外壳失活，增强其通透性，另一方可以增强染料的活性，增加计数结果(图4a)，但温度过高对染色结果也不利.孵育时间不足，将导致染色不充分，病毒峰与背景峰交叠，不能准确计数，当孵育时间大于10 min后，计数结果保持稳定(图4b).(a)孵育温度的影响(b)孵育时间的影响图4 孵育温度和时间对病毒计数的影响Fig.4 Effects of incubation process on baculovirus counts2.4 重复性和线性性检测对于重复性，8次实验结果的平均值为1.22×1010病毒颗粒/mL，最大值为1.43×1010病毒颗粒/mL，最小值为1.01×1010病毒颗粒/mL，CV值为2.4%，这表明该方法的重复性较好.对于线性性，从图5可知，病毒滴度在106～107病毒颗粒/mL范围内，线性性较好(R2=0.999 8).图5 不同加入体积的病毒计数Fig.5 Virus counts of different volume of viral solution注：固定前所有样本均加入PBS缓冲液稀释至960 μL终体积.2.5 流式细胞术与终点稀释法的计数结果比较分别采取流式细胞术和终点稀释法测定同一批病毒的滴度，测量结果如表2所示.从表2可知，流式细胞术的重复性(CV=2.4%)明显优于终点稀释法(CV=25.7%).表中流式细胞术的测量结果是终点稀释法的13.7倍，这是因为流式细胞术是直接计数病毒，而终点稀释法测量的是感染单位.一个感染单位对应多个病毒颗粒，所以流式测量结果大于终点稀释法.表2 终点稀释法与流式细胞术测量结果的比较Table 2 Comparison of virus quantitation results obtained by FCM analysis and by EPDA方法测量次数测量平均值CV/%终点稀释法58.9×108TCID50/mL25.7流式细胞术81.22×1010病毒颗粒/mL2.403 结语病毒最佳染色条件：4 ℃下，0.1%的多聚甲醛固定病毒样本30 min，然后加入SYBR Green I在80 ℃下避光染色10 min.经改进后的流式细胞术测定杆状病毒的方法能够快速而准确的测定杆状病毒的滴度.参考文献：[1]Thomas A K, Condreay J P, Donald L J. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells[J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(5): 567-575.[2]Radford K M, Cavegn C, Bertrand M, et al. The indirect effects of multiplicity of infection on baculovirus expressed proteins in insect cells secreted and non-secreted products[J]. Cytotechnology, 1997, 24: 73-81.[3]Zhang Y H, Enden G, Merchuk J C. Insect cells-Baculovirus system: Factors affecting growth and low MOI infection[J]. Biochem Eng J, 2005, 27(1): 8-16.[4]O'Reilly D R, Miller L K, Luckow V A. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual[M]. New York: Oxford University Press, 1994: 132-134.[5]Hink W F, Vail P V. A plaque assay for titration of Alfalfa looper nuclear polyhedrosis virus in cabbage looper (TN-368) cell line[J]. J Invertebr Pathol, 1973, 22: 168-174.[6]Marie D, Brussaard C P D, Thyrhaug R, et al. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(1): 45-52.[7]Brussaard C P D. Optimization of procedures for counting viruses by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(3): 1506-1513.[8]Shen C F, Meghrous J, Kamen A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry[J]. J Virol Methods, 2002, 105(2): 321-330.[9]Fineey D J. Statistical Method in Biological Assay[M]. 3rd ed. London: Charles Griffin & Co., 1978: 394-401.。

测定病毒滴度的方法Protocol:1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。

放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。

例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105 个细胞；2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。

对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL 。

避免漩涡震荡；3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。

另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。

注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL ；4) （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。

轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。

放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml （用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。

工作浓度是 6ug/ml 。

5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。

放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。

去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。

注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；9) 先加入95%甲醇固定10min,再 加入结晶紫染色液（6 孔板每孔 1mL ）并放置室温孵育10 分钟；10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。

该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。

说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

背景技术[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。

杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。

杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。

[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。

杆状病毒滴度测定步骤（利用工程细胞系Tn5ET终点稀释法快速测定杆状病毒滴度）1）用培养基（Grace’s 改良培养基JYT-M0042+10%FBS，下文中所有的培养基均为此培养基）稀释Tn5ET细胞悬液至细胞浓度约5×104个/ml，将Tn5ET&P细胞悬液滴加在96孔细胞培养板中，每孔100µl（即5×103cell/well）。

2）27℃培养箱培养，为了防止脱水，用封口膜将培养板四周封上，然后套上自封袋，将培养板置于培养箱内培养。

培养24h后细胞的汇合度约为30%~50%，此密度适合接种病毒。

3）在离心管中用培养基（将Bacmid病毒液连续作10倍梯度稀释，从10-1至10-6、10-7、10-8、10-9 、10-10、10-11、10-12。

4）取稀释好的Bacmid病毒液50 µl接种到含有100 µl Tn5ET细胞悬液的96孔微量培养板中，每一稀释度接种一行共12孔。

留一行作为阴性孔，每孔加入50 µl培养基。

5）27℃培养箱培养，为了防止脱水，用封口膜将培养板四周封上，然后套上自封袋，将培养板置于培养箱内培养。

培养72h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞，连续观察2~3天记录结果，直至不再有新的感染孔出现。

6）检测每孔的病毒复制情况，在荧光显微镜能检测到荧光信号的即为感染阳性。

不同稀释度条件下的病毒感染情况，则为该梯度下所有阳性感染数之和。

统计方法如下：n+(10-5)=n(10-5)+n(10-6)+n(10-7)+n(10-8)+n(10-9)+···n+(10-6)=n(10-6)+n(10-7)+n(10-8)+n(10-9)+···n+(10-7) = n(10-7)+n(10-8)+n(10-9)+···n+(10-8) = n(10-8)+n(10-9)+···n+(10-9) = n(10-9)+···同理统计未感染病毒数，获得病毒在不同稀释梯度下的感染率，从而获得感染率大于和小于50 %最近的两个稀释度，即为病毒感染相关浓度。

病毒滴度测定方法病毒滴度测定方法是一种用于测定病毒在溶液中的浓度的实验方法。

病毒滴度是指单位体积中含有的病毒颗粒数，通常以每毫升（mL）为单位。

病毒滴度的测定对于病毒学研究和疫苗生产具有重要意义。

本文将介绍常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤。

一、细胞培养法。

1. 准备培养皿和细胞悬液，将含有适量细胞的培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。

用无菌PBS或生理盐水洗涤细胞，用含有适量生长培养基的管中悬浮细胞。

2. 制备病毒稀释液，将病毒溶液以一定比例加入生长培养基中，得到一系列不同浓度的病毒稀释液。

3. 感染细胞，将不同稀释度的病毒溶液加入培养皿中的细胞悬液，孵育一定时间后观察细胞形态变化。

4. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒稀释液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。

二、血凝法。

1. 准备血凝管，将一定量的新鲜血液加入血凝管中，加入适量的病毒溶液，轻轻摇匀。

2. 孵育，将血凝管放置在37摄氏度的恒温箱中孵育一段时间，观察血凝情况。

3. 计算滴度，根据血凝管中凝结的情况，结合之前加入的病毒溶液的稀释倍数，计算出病毒的滴度。

三、组织培养法。

1. 准备组织培养皿和组织细胞，将含有适量细胞的组织培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。

2. 感染组织细胞，将病毒溶液加入培养皿中的组织细胞，孵育一定时间后观察细胞形态变化。

3. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒溶液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。

以上是常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤，选择合适的方法取决于实验目的、病毒类型和实验条件。

在进行病毒滴度测定实验时，应严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。

希望本文能对病毒滴度测定方法有所了解和帮助。

蚕 业 科 学 CANYE KEXUE 2009;35(3)收稿日期:2009-05-29资助项目:国家重点基础研究发展计划 973 项目(编号2005CB121005)。

作者简介:王文兵(1966-),男,江苏,副研究员。

Te:l 0511 ********,E m ai:l w enb i ng w ang @u j s 通信作者:沈卫德,教授,博士生导师。

Te:l 0512 ********,E m ai:l shenw d @suda 利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染王文兵1马双双1李 兵2叶思思3高 静3沈卫德2(1江苏大学生命科学研究院,江苏镇江 212013;2苏州大学生命科学学院,江苏苏州 215123;3江苏大学药学院,江苏镇江 212013)摘 要 尝试将红色荧光蛋白(RFP )作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp 基因的读码框,通过Bac to Bac 杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmN PV )中,获得重组杆状病毒B mNPV rfp 。

对家蚕细胞的感染表明,rfp 适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP 可以作为杆状病毒表达的分子标签。

B mNPV rfp 和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp 的家蚕重组杆状病毒BmN PV g f p 混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。

BmN PV r f p 、BmN PV g f p 与A c NPV 混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示A c N PV 可以协助BmN PV 来源的病毒基因在S f 21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。

关键词 红色荧光蛋白;绿色荧光蛋白;家蚕核型多角体病毒;苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒;细胞感染;组织感染中图分类号 S884.5;S881.2 文献标识码 A 文章编号 0257-4799(2009)03-0634-04I nf ecti on Anal ysis of Reco m bi nant Bo mbyx moriNucl eopol yhedr ovir us to I nsect Cell s and Bo m byx mori T i ssues by Obser vati on of Red and Gr een Fl uor escenceWANG W e n B i n g 1 MA Shua ng Shua ng 1 LI B i n g 2 YE S i S i 3 GAO J i n g 3 SHEN W e i D e2*(1I ns tit u t e o f L if e S c i e nc e,J i a ng su U n i ve rs i ty,Z he n ji a ng J i a ng su 212013,C h i na;2S c ho o l o f L i fe Sc i e nce s,S o oc how U n i v e rs it y,S uzho u J i a ng su 215123,C h i na;3Sc ho o l o f P ha r m a c y,J i a ng s u U n i ve rs ity,Z he n j i a ng J i a ng su 212013,C h i na )Ab s tra c t I n o rde r to know w he the r the r e d fl uo re sce nt p ro t e i n (RFP)co ul d be used a s a m o l ec ul a r m a rke r i n ba cu l ov irus exp re ss i o n s ys t em,t he ope n re ad i ng fram e o f rf p g e ne w a s c l o ne d and i n se rted i nto Bomb yx m o ri nuc l e o po l y hed ro v irus (BmNPV)g e nom e.The re com b i n an t v i rus B m NPV rfp w as ob ta i ne d .The res ult s o f i n f e c ti o n i n B m N c e l l s dem ons tra t ed t ha t t he rfp g e ne w a s h i g h l y e xp re ssed a nd w a s suit a b l e f o r a pp li ca ti on a s a fus i ng m a rke r .W he n the m i xed v i ruse s o fBm NPV rf p and Bm NPV g f p i nf e c ted BmN ce ll s and Bom b yx m o ri l a rv ae,sep a ra ted fl uo resc en t li g ht (red o r g re e n)w as o bse rved i n the i nf e c ted c e l l s ,m e an i ng tha tm os t i nse c t ce ll s a re o nl y se ns i ti v e by o ne tm i e to the v iri ons tha t de r i v e d from t he s am e t ype o f ba cu l o v irus.I n f ec ti o n o f S f 21ce l l s by m i x e d v iruses o f BmN PV rf p ,BmNPV g fp a nd AcNPV (Au t o g rap ha c a l if o rni ca NPV)a l so p ro ved the abo ve c onc l u s i on .Furt he r m o re,it show e d tha tAcNPV c ou l d he l p g e ne e xp res s i o n and v i ra l am p lifi c a tion o f the v iruse s de ri v ed from Bm NPV o r to f o r m hyb ri d v i ruse s i n S f 21ce ll s .Ye t the m e c ha ni sm rem a i ns f o r furthe r s tudy .Ke y w o rd sRed fl uo res c e nt p ro te i n ;G ree n fl u o re sce n t p ro t e i n ;Bom by x m o ri nuc l e op o l y hed ro v irus ;A u t o g ra p ha c a lif o rn i c a nuc l e o po l yhe d ro v irus ;I n fe c ti o nto c e l ;l Infe c ti o n t o ti ssue634杆状病毒(baculov irus)是有囊膜的双链DNA 病毒,为已知昆虫病毒中的最大类群,其宿主域仅限于无脊椎动物[1]。

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.23C N 103364560 A (21)申请号 201310309787.5(22)申请日 2013.07.23G01N 33/577(2006.01)G01N 33/569(2006.01)(71)申请人武汉中博生物股份有限公司地址430070 湖北省武汉市东湖开发区珞狮南路517号(72)发明人李晶梅 朱薇 温文生 漆世华谢红玲 靖志强 李建 秦红刚廖园园(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222代理人张火春(54)发明名称一种测定杆状病毒滴度的方法(57)摘要本发明公开了一种测定杆状病毒滴度的方法，该方法包括如下步骤：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察；计算病毒的TCID 50。

本发明测定杆状病毒滴度的方法结合了间接免疫荧光，是一种直接判定各孔细胞是否感染的TCID 50测定方法，重复性好，得到的检测结果更为准确，不需要结合细胞病变来进行判断，没有主观和经验因素的影响。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图2页(10)申请公布号CN 103364560 A*CN103364560A*1/1页1.一种测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）昆虫细胞板的制备：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；（2）接种杆状病毒：将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔；（4）病毒滴度计算：计算病毒的TCID50。

病毒滴度测定方法病毒滴度测定是一种用于测定病毒浓度的方法，通常用于病毒学研究和疫苗生产中。

病毒滴度测定的结果可以帮助科研人员和生产工作者准确地了解病毒的数量，为后续的实验和生产提供重要参考。

本文将介绍病毒滴度测定的常用方法及操作步骤。

首先，进行病毒滴度测定需要准备一定数量的培养皿或培养瓶。

在实验操作前，需要将培养皿或培养瓶进行消毒处理，以避免外源细菌的污染对实验结果的影响。

另外，还需要准备好相应的培养基和试剂，以及需要测定的病毒样品。

接下来，将培养皿或培养瓶按照实验要求进行编号，并分别加入适量的培养基。

然后，将待测病毒样品按照一定的稀释倍数进行稀释，并将不同稀释倍数的样品分别滴入已加入培养基的培养皿或培养瓶中。

在滴定完成后，将培养皿或培养瓶进行培养，培养时间根据不同病毒的特性而定，通常在37摄氏度下培养24-72小时。

培养结束后，观察培养皿或培养瓶中的细胞形态和数量，根据病毒感染的细胞数量和形态变化来确定病毒滴度。

通常情况下，病毒感染的细胞数量越多，病毒滴度越高。

在观察完毕后，可以根据所用的稀释倍数和感染细胞的数量来计算病毒的滴度。

除了上述介绍的常规方法外，还有一些改良的病毒滴度测定方法，如TCID50法、PFU法等。

这些方法在实际应用中有其特定的优势和适用范围，可以根据实际需求选择合适的方法进行病毒滴度测定。

总之，病毒滴度测定是病毒学研究和疫苗生产中不可或缺的重要实验方法之一。

通过本文的介绍，相信读者对病毒滴度测定方法有了更清晰的认识，希望能对相关领域的科研人员和生产工作者有所帮助。