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Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。
此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。
*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。
*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统的应用及展望
侯庆华;侯英奇;梁念慈
【期刊名称】《广东医学院学报》
【年(卷),期】2006(24)6
【摘要】昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）是当今基因工程领域4大表达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
BEVS具有安全性高，对外源基因克隆容量大。
【总页数】3页(P628-630)
【作者】侯庆华;侯英奇;梁念慈
【作者单位】广东医学院生化与分子生物学教研室,广东湛江,524023;中央司法警官学院侦查教研室,河北保定071000;广东医学院生化与分子生物学教研室,广东湛江,524023
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.昆虫杆状病毒表达系统在动物疫苗研究的应用 [J], 杨旭东;朱庆贺;王刚;王爽;陈曦;王观悦
2.昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用 [J], 梁璐琪
3.杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展 [J], 刘春菊;任炜杰;王志亮
4.家蚕杆状病毒表达系统及其在口蹄疫疫苗研究中的应用 [J], 关洪鑫;李志勇;白银
梅;柳纪省
5.昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望 [J], 朱江;吴祥甫
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Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
RTS快速，无需克隆，表达量高。
成本高。
酵母哺乳动物细胞昆虫细胞RTS体外表达系统大肠杆菌昆虫杆状病毒与其他蛋白表达系统比较在辉瑞制药公司，杆状病毒是其第二大蛋白表达系统。
杆状病毒系统表达重组蛋白的优势表达量高（可达细胞总蛋白的50%），大多数为有生物功能的可溶性蛋白；可进行翻译后修饰；可进行磷酸化修饰；可形成正确折叠的二硫键；可进行N‐和O‐型糖基化修饰；可去除信号肽；易进行规模化生产，昆虫细胞比哺乳动物细胞操作简单；相对于其他真核表达系统成本较低；杆状病毒表达系统（BEVS）的发展BEVS系统由Dr. Max D. Summers, and Dr. Gale Smith在1982年研究提出； BEVS系统基于目的基因替代病毒基因组上一个极晚期，非必须的病毒蛋白（多角体蛋白）；大多数的转移载体使用早期启动子（le1）或极晚期启动子（p10，pPolyh）；AcMNPV DNA的改造和线性化是BEVS历史性改造；对于分泌性蛋白，HBM 和gp67是最常用的分泌信号肽；BEVS允许在昆虫细胞（Sf9, Sf21, Hi5）中快速克隆和表达重组蛋白。
杆状病毒表达系统（BEVS）Bac‐to‐Bac(Invitrogen™)杆状病毒表达系统（BEVS）BacPAK6/BaculoGold (BD Biosciences/Clonetech)◆E.coli lacZ基因插入到多角体位点◆引入多个Bsu361限制性酶切位点◆Bsu361限制性酶切位点的引入使得病毒◆DNA(ΔORF1629)在昆虫细胞中不能复制◆Bsu361不能100%切割病毒DNA使之线性化◆重组病毒仍需要进行空斑筛选杆状病毒表达系统（BEVS）BaculoDirect™(Invitrogen™)◆利用Gateway®技术直接将目的基因转移到病毒DNA上◆目的基因整合到病毒DNA的polh位点◆利用整合酶和特异位点（att）完成整合◆利用更昔洛韦（核苷类似物）筛选重组病毒◆更昔洛韦被HSV1 tk磷酸化后阻止野生型病毒基因组的复制◆需要大量病毒扩繁◆每次只能生产一种重组基因杆状病毒表达系统（BEVS）flashBAC™/BacMagic(EMD/OET/Nextgen)◆用人工细菌染色体（BAC）改造polh位点，使得病毒基因组可在大肠杆菌中复制◆ORF1629的删除阻止非重组的父代病毒不能在昆虫细胞中复制◆chiA基因的删除提高了分泌通路的效率◆适合自动化生产◆不需要空斑纯化不同BEVS系统比较flash BAC系统是一个全新的生产重组杆状病毒的技术平台，flashBAC专门设计，免去了从亲代病毒中筛选重组病毒的步骤，不需要进行空斑实验，一步法杆状病毒蛋白表达系统，目前最领先的杆状病毒表达系统。
OET—专业开发第二代杆状病毒表达系统表达系统flash BAC TM flash BACGOLD TM flash BAC ULTRA TM flash BACPRIME TM全球领先的重组蛋白表达系统，简单、快速、产量高。
病毒滴度滴定试剂盒baculo QUANT TM ALL ‐IN ‐ONE准确，快速测定病毒滴度。
病毒转染试剂flash FECTIN TM baculo FECTIN TM专用于昆虫细胞的高效转染试剂。
培养基baculo GROW TM昆虫细胞专用无血清培养基。
转移载体pOET TM transfer plasmids 简化的克隆和同源重组技术。
更简单：无需繁琐的筛选工作更快速：一步法，只需5天更高的蛋白产量：蛋白更稳定更高的蛋白活性：蛋白生物活性高适用于难表达的蛋白：分泌蛋白，膜蛋白，毒性蛋白flash BAC 表达系统：主要产品：Bac‐to‐Bac®(Invitrogen) flash BACGOLD表达条件优化温度对昆虫细胞生长的影响表达条件优化宿主细胞对分泌性蛋白的表达影响蛋白表达水平随目标蛋白的不同也有所不同表达条件优化( ‐) N a B u( ‐) N a B u+ 2m M N a B u 24h p i+ 2m M N a B u 48h p i( ‐) N a B u( ‐) N a B u+ 2 m M N a B u 24h p i+ 2 m M N a B u 48h p iM 17 45 67 93 117 17 45 67 93 117温度对蛋白表达及稳定性的影响24°C27°C20°C27°C诱导时间hr在Sf ‐21细胞中表达重组蛋白在Sf ‐9细胞中表达重组蛋白表达条件优化培养基和MOI对蛋白表达的影响MOI在1和5时对蛋白表达没有明显区别不同生长培养基会影响蛋白表达不同蛋白表达量也有所不同表达条件优化不同标签蛋白纯化翻译后修饰研究表明大多数的昆虫细胞中表达的重组糖蛋白不能外周糖基化修饰，比如唾液酸； 唾液酸在很多细胞‐细胞相互作用，免疫反应，循环糖蛋白的清除中起很重要的作用； Donald L. Jarvis博士设计改造了几种昆虫细胞可使重组蛋白像在哺乳动物细胞中那样； 进行唾液酸N‐糖链糖基化；翻译后修饰糖基化修饰在大肠杆菌系统中表达的蛋白检测不到糖基化 在酵母和昆虫细胞中有明显的糖基化翻译后修饰糖基化位点突变对蛋白表达的影响糖基化位点突变后蛋白表达水平降低翻译后修饰磷酸化修饰高水平表达的蛋白激酶可使重组蛋白过度磷酸化和异质性;研究发现几个商业载体上的His标签(MHHHHHHSSGLVPRGS）的色氨酸残基会发生磷酸化;标签蛋白色氨酸残基的过度磷酸化导致蛋白聚集，抵抗凝血酶的切割;用碱性磷酸酶可部分恢复凝血酶的灵敏性;在昆虫细胞表达系统中用冈田酸（蛋白磷酸酶抑制剂）可扩展标签蛋白磷酸化.规模化培养细胞●细胞起始密度2.0X106vc/ml●培养温度27℃●转速25rpm●气压0.1‐0.2lpm●培养72h 收获细胞高通量蛋白表达‐‐‐Nextgen工作站NextgenNextgen 杆状病毒工作站●Sf 9细胞(静置培养)•接种细胞，密度达2 x 105 /孔(0.4 ml 培养基)•用baculo 工作站把细胞混匀●共转染(聚苯乙烯)•聚苯乙烯试管/板子•100 ng flashBAC DNA •500 ng 转移载体•2μg 脂质或转染试剂●培养•28 ℃培养5 天flashBAC 系统在昆虫细胞中一步法生产重组病毒。
非常适合于高通量和自动化生产系统。
总结●商业化的BEVS系统让病毒重组及蛋白表达变得更简单；●大多数昆虫细胞系在不加血清培养基中快速生长，得到高滴度病毒和高产量重组蛋白；●规模化培养简单经济；●适合自动化生产；●表达人源化蛋白，昆虫细胞中糖基化途径克服人源糖蛋白的问题。
