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叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
叶绿素的测量方法叶绿素是植物和浮游生物体内的一种绿色色素，具有光合作用和光合细菌中也存在这种色素。
叶绿素对于生物体内的光合作用非常重要，因此对于叶绿素的测量方法，一直是科学研究和工程应用中的重要问题。
本文将介绍叶绿素的几种常用测量方法，旨在通过详细的介绍和分析，使读者对叶绿素的测量方法有更为全面深入的了解。
一、光学吸收法1.常用紫外-可见分光光度计法(UV-Vis)光学吸收法是一种广泛使用的叶绿素测量方法之一。
通过利用叶绿素对特定波长光的吸收特性，可以测量叶绿素的浓度。
常用的是紫外-可见分光光度计法(UV-Vis)。
通过用叶绿素标准溶液构建标准曲线来测定待测叶绿素溶液的浓度，精确、快速、准确。
2.高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法(HPLC)是一种专业的叶绿素测量方法，对于复杂样品的分离和测量更加准确。
利用HPLC技术，可以进一步分析不同种类的叶绿素和其同系物的含量。
二、荧光法1.光诱导荧光法(PAM)光诱导荧光法(PAM)是一种基于叶绿素光合效率的测量方法。
通过测量叶绿素在光合作用过程中释放的荧光信号，可以快速、准确地评估叶绿素的光合活性和健康状态。
2.激光诱导荧光法(LIF)激光诱导荧光法(LIF)是利用激光激发样品后产生的荧光信号来测量叶绿素含量和活性的一种方法，具有高灵敏度和高空间分辨率。
三、生物化学法1.粉末化学法粉末化学法是通过将叶绿素样品制成粉末，再用特定的溶剂提取叶绿素进行测定的方法。
这种方法操作简单，适用于对叶绿素的快速测量。
2.超声波破碎法超声波破碎法利用超声波的作用，能够快速破碎植物细胞壁，并释放出细胞内的叶绿素。
该方法操作简单、高效。
以上所述的叶绿素测量方法只是其中的几种常用方法，随着科技的不断发展，还有许多新的测量方法不断涌现。
在实际的应用中，根据需求和样品的特性选择合适的测量方法至关重要。
希望本文所介绍的叶绿素测量方法能够为相关研究和实际应用提供参考。
超高效液相色谱法快速测定烟草样品中的植物色素作者：王晋黄海涛刘欣许永李晶孔维松张涛张承明杨光宇李雪梅来源：《湖北农业科学》2018年第22期摘要：建立超高效液相色谱法快速测定烟草中植物色素（新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素-a、叶绿素-b、β-胡萝卜素）检测方法。
90%丙酮超声萃取30 min，色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-水梯度洗脱，以体积比按（乙腈90%+10%水），4.0 min（100%乙腈）的梯度条件，流速为0.8 mL/min，用二极管阵列检测器检测。
6种色素在5 min内分离，检测限15～22 ng/mL，平均回收率为93%～105%。
采用自主设计的样品萃取瓶进行前处理，前处理简单快速，同时，色谱分离周期明显缩短，与目前行业标准相比，样品分析效率提高了4倍以上。
关键词：超高效液相色谱;烟草;植物色素;快速测定中图分类号：O656.3; ; ; ; ;文献标识码：A文章编号：0439-8114（2018）22-0124-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2018.22.034; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Abstract： Established a ultra performance liquid chromatography（UPLC） method for the rapid determination of plant pigments（neoxanthin，violaxanthin，lutein，chlorophyll-a，chlorophyll-b and β-carotene） in tobacco. The plant pigments were extracted from samples with 90% acetone by ultra-sonic extraction. Then，the plant pigments were separated by Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column， with and water mixture as mobile phase at a flow-rate of 0.8 mL/min. It eluted with gradient elution （90% V（acetonitrile））+10% V （water）） at the beginning，then the gradient elution replaced by acetonitrile 4 min later. These plant pigments were detected by diode array detector. Under the optimal conditions，6 kinds of plant pigments could be effectively separated within 5 min. The limits of detection（LODs） of 6 kinds of plant pigments were 15～22 ng/mL and the average recoveries were in the range of 93% to 105%. Via the self-designed sample extraction bottle using for pretreatment，and improved chromatography conditions，this method efficiency was enhanced 4 times than the current tobacco standard.Key words： ultra performance liquid chromatography; tobacco; plant pigments; rapid determination植物色素是煙草生长和利用太阳能进行光合作用的重要物质，同时也是影响烟草品质的重要成分，它们对烟叶的色泽和香味也有着重要影响[1-4]。
植物生理指标测定方法植物生理指标是指用来衡量植物生理状况的具体参数或指标，在植物生理研究中起到了非常重要的作用。
植物生理指标测定方法主要包括以下几个方面：光合作用指标、呼吸作用指标、蒸腾作用指标、叶绿素指标、产量指标和抗逆性指标等。
1.光合作用指标的测定方法：(1)净光合速率的测定方法：通过光合速率仪测定植物叶片在光照条件下的净光合速率；(2)光饱和点和CO2抗饱和点的测定方法：通过对光合速率与光照强度或CO2浓度的关系进行测定，确定光饱和点和CO2抗饱和点；(3)光合色素含量的测定方法：通过分光光度计或高效液相色谱法测定叶片中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素等光合色素的含量；(4)光合机构有效光能利用率的测定方法：通过光合色素荧光分析仪测定叶片的光能利用效率。
2.呼吸作用指标的测定方法：(1)总呼吸速率的测定方法：通过呼吸速率仪或气体分析仪测定植物组织在不同温度条件下的总呼吸速率；(2)细胞内呼吸速率的测定方法：通过氧和二氧化碳分压差法或氧电极法测定细胞内的呼吸速率。
3.蒸腾作用指标的测定方法：(1)蒸腾速率的测定方法：通过蒸腾速率仪测定植物叶片在不同光照和湿度条件下的蒸腾速率；(2)水分利用效率的测定方法：通过测量蒸腾速率和光合速率的比值来反映植物对水分的利用效率。
4.叶绿素指标的测定方法：(1)叶绿素含量的测定方法：通过叶绿素荧光分析仪或高效液相色谱法测定叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量；(2)叶绿素荧光动力学特性的测定方法：通过荧光指数、叶绿素荧光参数和叶绿素荧光成像等技术来评估叶绿素在光抑制和光保护状态下的变化。
5.产量指标的测定方法：(1)单株产量的测定方法：通过对植株生物量、籽粒数或实际产量的测定来计算出单株产量；(2)单穗产量的测定方法：通过对穗长、穗粒数和粒重的测定来计算出单穗产量；(3)单粒产量的测定方法：通过对单穗粒数和粒重的测定来计算出单粒产量。
6.抗逆性指标的测定方法：(1)抗氧化酶活性的测定方法：通过测定植物组织中抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等的活性来反映植物的抗氧化能力；(2)渗透调节物质含量的测定方法：通过测定植物组织中渗透调节物质（如脯氨酸、脯氨酸激酶等）的含量来评估植物的胁迫适应能力；(3)膜脂过氧化程度的测定方法：通过测定植物组织中膜脂过氧化程度的指标，如丙二醛和过氧化氢含量来评估植物膜的稳定性。
叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱
叶绿素和类胡萝卜素是植物体里绿色染料的最重要物质，是植物在吸收日光能
量过程中起着关键作用的物质。
本次研究利用植物叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱，进行定量分析，以期揭示植物中表面电荷作用的分布及存在的机制。
研究人员选择了六种不同类型植物对叶绿素和类胡萝卜素的吸收特性进行测量，并运用聚焦四线调整技术和精密重复性建立起了谱记录的标准。
利用谱记录可以有效的鉴别叶绿素和类胡萝卜素的变化，通过特征谱段的光吸收系数分析出不同植物叶绿素和类胡萝卜素的特征，从而得出各类植物对叶绿素和类胡萝卜素的吸收能力差异。
数据表明，在植物表面电荷颗粒膜中，叶绿素和类胡萝卜素都可以形成低电位
静电场，而且还可以存在各种复杂的水溶性物质，使得植物叶片表面电荷变得更加复杂。
这就是植物的叶片根据这些环境因素的变化，对叶绿素和类胡萝卜素的吸收能力有差异的原因。
以上研究表明，叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱有助于研究植物表面电荷特征
及其生态学影响，从而为我们提供了最全面的了解植物结构和功能的参考。
叶绿素的含量测定方法
测定叶绿素含量的常用方法有：
1. 光度法：根据叶绿素的吸收特性，通过光度计测量叶片样品在特定波长下的吸光度，再根据标准曲线计算叶绿素含量。
2. 高效液相色谱法（HPLC）：使用高效液相色谱仪测定叶片中叶绿素的含量。
该方法准确度高，适用于对叶绿素含量要求较高的研究。
3. 比色法：将叶绿素与醋酸酐反应生成叶绿素醋酸酯，根据生成的产物在特定波长下的吸光度测量叶绿素含量。
4. 荧光法：利用叶绿素的荧光特性，通过测量叶片样品在特定波长下的荧光强度来确定叶绿素含量。
这些方法都有各自的优缺点和适用范围，具体选择哪种方法应根据实际需要和实验条件来确定。
在进行叶绿素含量测定时，确保使用标准操作程序和仪器校准，以获得准确可靠的结果。
叶绿素含量的测定方法1、实验原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶液的质量浓度C和液层厚度L成正比，即 A=αCL式中，α为比例常数。
当溶液浓度以质量浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光值。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知质量浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合物在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
要测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、叶绿素b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
由于叶绿体色素在不同溶液中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。
叶绿素a、叶绿素b在体积分数为95%的乙醇中最大吸收峰的波长为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，据此列出关系式为C a=13.95A665-6.88A649C b=24.96A649-7.32A665C c=(1000A470-2.05C a-114.8C b)/245C a为叶绿素a的质量浓度，C b为叶绿素b的质量浓度，C c为类胡萝卜素的质量浓度，单位都是mg/L2、器材准备：分光光度计，百分之一天平，研钵，棕色容量瓶（25mL），小漏斗，滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管。
3、溶剂的制备：1）95%乙醇 2）石英砂 3）碳酸钙粉4、实验步骤：（1）取新鲜植物叶片，擦干净表面，剪去叶中脉，只取叶片（2）取新鲜植物叶片样品2g，放入研钵中，加少量石英砂及2-3mL95%乙醇，研成匀浆，再加10mL95%乙醇，研磨至组织变白。
高效液相色谱法同时测定叶绿素和类胡萝卜素
一、实验目的
1、了解高效液相色谱在叶绿体色素全分析的应用。
2、掌握生物样品的高效液相色谱实验技术。
3、初步掌握梯度洗脱实验技术。
二、测定意义
植物光合色素的分析方法有许多种,经典的方法有纸层析和薄层层析,薄层层析又根据吸附剂不同而分成几种类型。
吸附剂的类型有:硅胶、硅藻土、糖类、纤维素和聚酰胺等。
层析后的各个色素斑点剪下并用相应的溶剂溶解后测定其吸收光谱,对照文献资料再确定色素的种类。
上述方法较简便,但准确性不高。
近几年随着高效液相色谱技术的发展,有人已将它应用于植物色素的分析中。
从植物提取液分离出来的叶绿素和胡萝卜素已发现有多种异构体，而且常常是同时存在的。
因此对叶绿素和胡萝卜素的深入研究较为困难。
高效液相色谱既能对单一组分进行定量，又能对混合物中的多组分在分离的基础上进行定量。
既能用于主要成分的含量测定，又能用于微量和痕量组分的测定。
高效液相色谱是一种准确度好和精密度高的分析技术。
因此，尽管难以得到所有的植物色素标准品，但高效液相色谱技术仍被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一种最有效手段。
三、基本原理
叶绿体色素提取液可以采用正相或反相高效液相色谱法分析，实验表明，反相高效液相色谱法更加方便。
但由于色素提取液各组分的极性差别较大，等度洗脱可能使某些组分的分离不够完全。
因此，对植物色素提取液的全分析应采用梯度洗脱方式以改善分离和缩短分析时间。
本实验采用高效液相色谱法可对绿色植物叶片提取液中的色素进行较全面的分离，并直接测定叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素的含量。
四、仪器与试剂
1. 岛津LC-20 高效液相色谱仪，色谱工作站，微量进样器（100 μl），Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm)。
2. 叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素纯品为Sigma公司产品，甲醇、二氯甲烷和乙腈为
液相色谱淋洗剂，实验用水为二次去离子水（娃哈哈纯净水），经玻璃系统重蒸馏。
五、实验内容
1. 色素的提取：取0.5 g左右干净的新鲜的去脉菜叶，准确称重。
剪碎，置于研钵中，加0.1 g MgCO3和 5 mL 90% 丙酮，研磨至浆状，分次加入5 mL 丙酮，沥出提取液。
高速离心后，移出上清液。
重复提取直至植物组织无色。
合并上清液，转入50 mL容量瓶中，以90% 丙酮定容。
试液经过0.2 μm 针筒式微孔滤膜过滤器直接注入色谱仪分析。
2. 流动相的配制：实验前，配制二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v）流动相。
流动相需用0.45 μm微孔膜过滤，并经超声波除气15 min后使用。
3. 色谱条件试验：色谱柱为Hypersil BDS C18(
4.0mm×200 mm，5μm），另加一20 mm C18的保护柱。
流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v），流速为1.5 mL/min，检测波长为440 nm和660 nm。
进样体积为20 μL。
4.工作曲线的绘制:于5个10 mL容量瓶中，分别移入0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL 0.10 mg/L色素标准混合液，用流动相定容，然后分别进样分析。
为提高各个组分的检测灵敏度，可设定一个检测波长-时间程序进行检测。
在0~50 mg/L范围内，叶黄素、叶绿素b、叶绿素a和β−胡萝卜素的浓度应与峰面积呈现良好线性关系。
计算相应的回归方程和相关系数。
5．实际样品测定：菠菜色素提取物经0.2μm针头式过滤器直接进样分析。
六、数据处理
1．分别绘制各标准样品的工作曲线，线性范围。
对照工作曲线计算各组分含量。
2．利用保留时间对各组分定性。
七、问题讨论
讨论组分出峰的顺序。
在正相色谱体系中组分的出峰次序为：极性弱的组分，在流动相中溶解度较大，因此k值小，先出峰。
极性强的组分，在固定相中的溶解度较大，因此k值大，后出峰。
在反相色谱中组分的出峰次序为：极性弱的组分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反极性强的组分在流动相中溶解度大，k值小，所以先出峰。
标准试液组分的出峰顺序依次为叶黄素、叶绿素b、叶绿素a和β−胡萝卜素。
八、注意事项
1、在所有的提取过程中，应尽可能防止色素发生分解、氧化。
操作过程中均应在避免高温、强光照射、高湿度、低pH值条件下迅速完成。
2、色素提取液可能含有不溶物（如植物组织），必须除去，否则将缩短柱寿命。
实验过程采用保护柱和针头过滤器保护色谱柱。
3、开启仪器应按操作规程，观察仪器参数是否在设定范围内。
待仪器稳定后，方可进样分析。
4、每完成一种试液分析，应用丙酮等溶剂将进样注射针彻底洗干净。
否则会引起样品残留，影响下一个样品分析。
5、实验结束，应按规定清洗仪器，方能关机。
九、思考题
1．在HPLC中，采用双波长检测有什么好处？如何确定色谱峰的纯度？
2．为什么要进行梯度洗脱？在梯度洗脱过程中要注意哪些问题？
3．对生物样品进行高效液相色谱分析，应对进样溶液做那些预处理？
4．如何确定待测组成的色谱峰及含量？
5．对比同一份植物叶片试液的三种分析结果，简述导数分光光度法、同步荧光法和高效液相色谱法的特点。
