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《叶绿体色素的提取和分离》实验报告
叶绿体是植物细胞中的一种细胞质器，主要功能是光合作用。
叶绿体包括一系列色素，其中最重要的是叶绿素。
在本实验中，我们将提取和分离叶绿体色素，以便进一步分析其
结构和功能。
实验步骤：
1. 从新鲜的叶子中剪下片段，用无菌蒸馏水洗涤。
2. 用离心机将叶片离心，离心速度为1000 rpm，时间为5分钟。
3. 将上清液取出并过滤，过滤剂为细孔过滤纸。
5. 将上清液取出，并用1ml无菌蒸馏水洗涤叶绿体色素。
7. 取出上清液，将其光度值调至0.4-0.6。
（400nm处）
8. 将上述上清液转入紫外吸收仪中，观察叶绿素的吸收曲线。
实验结果：
实验得出的叶绿体色素提取液中，吸收最强的波长为680nm和430nm。
这对应着叶绿
体和类胡萝卜素的吸收峰。
实验得到的叶绿体色素移液后，需要经过离心的过程，这样可去除混杂物质，获得更
为纯净的叶绿素。
通过以上实验，我们成功地提取和分离了叶绿体色素。
叶绿素是植物所特有的，它起
到了光合作用的关键作用。
实验中的提取和分离方法，可以为进一步的分析叶绿素的结构
和功能提供帮助。
叶绿素的提取和分离实验报告叶绿素的提取和分离实验，这可真是个有趣的课题。
想象一下，阳光下的小植物，满身的绿色，就像穿着翠绿衣裳的小精灵。
你可知道，叶绿素可不是简单的东西，它可是植物的“魔法武器”。
今天咱们就来聊聊这个实验，顺便看看怎么把叶绿素提取出来，真是让人充满期待啊。
准备工作可得做足。
找几片新鲜的绿叶，最好是一些比较嫩的，比如菠菜或者其他绿叶蔬菜。
小伙伴们，记得洗干净哦，卫生第一。
然后，撕碎这些叶子，越小越好，这样才能让叶绿素更容易释放出来。
这一过程就像是在给小植物“做美容”，哈哈。
撕的过程中，脑海里不禁浮现出那些清新的味道，真是让人忍不住想咬一口。
咱们要用到一些工具。
把撕碎的叶子放进研钵里，加入一些酒精，建议用乙醇。
酒精可真是个好帮手，它能把叶绿素从叶子里“撇”出来。
用杵子慢慢研磨，直到叶子变成绿油油的糊状。
这一刻，感觉自己就像是个小炼金术士，手里的东西似乎在变得神奇。
油绿的汁液渐渐渗出来，真是让人心花怒放。
这时候，你会发现，液体的颜色开始变得浓郁。
小心翼翼地把混合物过滤到一个试管里，别让那些叶子的渣滓混进来哦，咱们要的可是纯粹的叶绿素。
就像在筛选黄金一样，真是小心翼翼。
一过滤，看到清澈的液体，那一瞬间，心里不禁乐开了花，感觉这就是成功的象征。
可以用薄层色谱法来分离叶绿素。
想象一下，在薄层板上，一滴滴的液体就像小小的水滴，兴奋地准备出发。
小心地把试管里的液体滴在板上，然后将薄层板放入含有溶剂的小容器里。
那一刻，真的感觉自己像是在观看一场精彩的表演。
随着时间的推移，液体在板上缓缓移动，颜色也在不断变化。
简直是科学和艺术的结合，太美了！经过一段时间，取出薄层板，看到上面的色带，一条条的，绿的、黄的、甚至还有些微微的蓝色。
这时候，心里默念：“这就是大自然的调色板！”咱们可以用尺子量量这些颜色的距离，分析一下不同色带的组成，原来叶绿素还有好几种呢。
真是让人意外，看来这小小的绿叶，藏着的秘密可真不少。
植物生理学实验报告实验题目：叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定姓名班级学号一、实验原理和目的目的：1.练习叶绿素提取和分离的方法2.进一步了解叶绿素色素成分提取、分离原理：1、溶解性。
叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取2、吸附性。
滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。
二、实验器具和步骤材料:新鲜植物叶片器具：研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张试剂：95%乙醇，石油醚步骤：1.色素提取（乙醇粗提液）a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉称1g左右剪碎于研钵b.研钵中加3-5ml95%乙醇研磨成匀浆过滤于刻度试管残渣用少许乙醇冲洗一并过滤定容至10ml2.荧光观察将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光3.色素萃取（石油醚提取液）取乙醇提取液5ml与另一支试管加2ml石油醚摇荡静止片刻上层深绿色为石油醚提取液4.色素分离a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘与纸芯紧贴且露出少许，最好相平）用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端待风干后再滴加几次b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央将插上纸芯的滤纸放在培养皿上纸芯下端浸入石油醚迅速盖好培养皿。
c.推动剂前缘接近滤纸边缘时取出滤纸，风干可见分离色带，用铅笔标出各种色素位置和名称三、实验数据和作业四、数据分析研磨叶片不充分，提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显分离色带较少的原因：提取的叶绿素的浓度稀胡萝卜素叶黄素。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。
叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。
另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。
因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。
实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
纸层析是其中最简单的一种。
当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。
强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。
而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。
生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质一、提取与分离1、实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。
如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。
流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤（1）色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。
加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。
Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。
二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。
叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。
叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。
在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
[原理]叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。
叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。
利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
其数学表达式为：A=Kbc式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。
叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。
叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.76Ca+45.60Cb（2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A663—2.59A645(3)Cb=22.9 A645—4.67A663(4)Ca十b＝20.3 A645—8.04A663(5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。
叶绿素的提取和分离
叶绿素是植物中常见的一种色素，可以通过以下步骤提取和分离：
1. 选择适当的植物材料：选择含有较高叶绿素含量的植物材料，如深绿色的叶子。
2. 破碎细胞壁：将选取的植物材料破碎细胞壁，可以通过搅拌、研磨或者用搅拌机处理。
3. 提取叶绿素：加入适量的提取剂（如丙酮、乙醇、酒精等），使植物细胞中的叶绿素溶解到提取剂中。
可以将细胞破碎后的混合物过滤，得到含有叶绿素的提取液。
4. 离心：对提取液进行离心，以分离植物残渣和叶绿素提取液。
离心可以加快叶绿素的沉淀速度。
5. 分离和纯化叶绿素：可以使用色谱技术（如薄层色谱、柱层析等）对叶绿素提取液进行分离和纯化。
通过色谱技术可以将不同种类的叶绿素分离开来。
以上是叶绿素的提取和分离的一些常用步骤，具体的操作方法和条件可以根据具体实验目的和材料的不同而有所调整。
普通生物学实验实验报告一、实验名称叶绿素的提取分离与理化性质二、实验目的1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法2.验证叶绿体色素的多种理化性质三、实验原理1.叶绿素中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素是色素蛋白复合体，不溶于水而易溶于有机溶剂，可以用乙醇进行提取。
2.由于硅胶板的吸附剂对不同色素的吸附能力不同，不同色素在展开剂中的溶解度不同，因而叶绿素提取液进行薄层层析时各组分移动速度不同而分开，因此可以用薄层层析法对色素进行分离，进而对色素进行观察鉴别。
3.叶绿素是由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复合酯，能与碱性物质发生皂化反应生成甲醇和叶绿醇及能溶于水的叶绿酸盐，从而绿色素和黄色素分离。
4.叶绿素可以吸收光量子变成不稳定的激发态，当它变回基态时可发射红光量子产生荧光。
5.叶绿素的化学性质不稳定，在强光照下易被破坏，类胡萝卜素则较稳定。
6.叶绿素中的镁可被氢离子取代生成绿色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素可与铜离子反应生成稳定的铜代叶绿素。
四、实验仪器和材料1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95％的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂。
3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，毛细玻璃管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
4.刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10mL移液管。
5.苯，醋酸铜粉末，质量分数为5％的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。
五、实验步骤1.叶绿素提取液的制备2.叶绿体色素的分离3．光对叶绿素的破坏作用取两只小试管，各加入2.5mL 的叶绿素提取液和2.5mL 的95％乙醇。
一支试管放在直射阳光下，另一支试管用锡箔纸包严，均静置40分钟。
4.皂化作用5.H 离子和Cu 离子对叶绿素Mg 离子的取代作用1) 取两只试管，试管1中加入5mL 叶绿素提取液作为对照。
试管2中加入5mL叶绿素提取液后再加入质量分数为5％的盐酸数滴并摇匀，当溶液变褐后再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化并和试管1比较。
叶绿体色素的提取、分离及理化性质鉴定
实验目的了解叶绿素提取分离原理、方法，验证理化性质
实验原理叶绿素易溶于乙醇、丙酮，类胡萝卜素更易溶于苯；
叶绿素是双羧酸脂类，能与强碱发生皂化反应；
叶绿素分子中络合的镁能依次被H+、Cu2+取代；
叶绿素溶液光照后有荧光现象。
实验器材试管、研钵、太平、毛细滴管、剪刀、移液管、展层缸、滤纸、漏斗、50ml容量瓶、酒精灯、试管夹
实验试剂乙醇、丙酮、苯、盐酸氯化铜混和液、甲醇、氢氧化钾、石英砂
实验材料菠菜叶片
实验步骤
一、叶绿体色素的提取、分离
1、提取：叶片2g剪碎，放入研钵，加乙醇（或丙酮）5ml研磨匀浆，再加10ml，
过滤。
2、分离：滤纸一张，用毛细管在圆心处分次滴加提取液，圆心处穿孔，然后
插入滤纸圆芯；将其放入盛有展层液（汽油或丙酮：苯：石油醚＝9：1：
0.1混和液）的展层缸内，30min.后观察结果。
叶绿体色素被分离成从内
到外的篮绿（叶绿素a）、黄绿（叶绿素b）、浅黄（叶黄素）、橙黄（胡萝卜素）四个同心圆环。
二、叶绿素理化性质鉴定
1、荧光现象观察：浓提取液向光观察呈绿色，背光观察呈血红色（荧光）
2、皂化反应：加提取液0.5ml至试管，加入氢氧化钾的甲醇饱和液2ml，沿
管壁加水2ml，管内有乳白色沉淀出现（皂化）。
加苯1ml，静置5min，上层苯层呈深黄色（类胡萝卜素）。
3、取代反应：加提取液0.5ml至试管，加水2ml，加盐酸氯化铜混和液2ml，
用酒精灯慢慢加热，仔细观察溶液颜色依次有绿变褐（氢取代）再变篮绿（铜取代）。
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。
2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
实验二叶绿素的提取和分离一、实验目的从富含叶绿素的菠菜叶片中提取叶绿素，并在薄层层析板上点样使叶绿素显示不同颜色。
二、实验原理要求同学们先查询资料，了解叶绿素相关知识，实验课上老师讲解。
三、实验材料、器具研钵、托盘天平、分液漏斗、干燥锥形瓶、毛细管、薄层层析板、饱和NaCl溶液、无水Na2SO4四、实验步骤1、叶绿素的提取在中放入几片(约5g)菠菜叶(新鲜的或冷冻的都可以．如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分)。
加入10mL2:1石油醚和丙酮混合液，适当研磨。
将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。
将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g无水Na2SO4，通风处理。
处理后的液体倾至另一锥形瓶中(如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩)。
2、点样用一根内径1mm的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端1cm 处，平行点两点，两点相距1cm左右。
若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后．再在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过2mm。
3、展开先在小烧杯中放入展开剂[用石油醚和丙酮按3：1的比例进行混合作为展开剂，再将薄层板斜靠于层析缸内壁。
点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂中，密闭层析缸。
待展开剂上升到距薄层板另一端约1cm时，取出平放，用铅笔或小针划前沿线位置，在空气中晾干或用电吹风吹干薄层。
毛细管点样薄层色谱展开4、观察层析板并记录实验结果。
薄层层析时Rf值表示的是原点到层析斑点中心的距离与原点的到展层溶剂的前沿距离包括扩散最快的是什么，扩散最慢的是什么最宽的色素带是什么，最窄的色素带是什么哪两个色素带距离相距最远，哪两个最近等等各种色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散的快，反之则慢。
最快：胡萝卜素次之：叶黄素次之：叶绿素A最慢：叶绿素B颜色分别为：橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色，最宽的是叶绿素A最窄的是胡萝卜素胡萝卜素和叶绿素B最远叶绿素A和叶绿素B最近实验十四、植物色素的提取和薄层色谱分析一、实验目的：1、了解薄层色谱的基本原理和应用。
2、掌握薄层色谱的操作技术。
二、实验原理：1、原理薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。
样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。
由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。
2、薄层色谱的用途：1）化合物的定性检验。
（通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定）在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（Rf 值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离溶质最高浓度中心至原 f R2）快速分离少量物质。
（几到几十微克，甚至0.01µg）3）跟踪反应进程。
在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。
4）化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。
）此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
3、色谱法色谱法是与植物天然色素的分离提取同时发展起来的.色谱法(纸色谱,薄层色谱和柱色谱)至今仍然是分离叶绿素等天然色素最有效的方法。
色谱法分离叶绿体色素的基本原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数,或在吸附剂上的吸附能力的不同,当它们通过色谱柱/床时,这种分配或吸附过程反复多次地进行,最后将它们一一分离开来。
通常认为,纸色谱属于分配色谱.它是以滤纸为惰性支持物,滤纸纤维一般能吸收约20 % 的水分,其中有6~7 % 以氢键形式与纤维素上的羟基结合,构成纸色谱的固定相.在展开过程中,被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配, 龙岩学院分析化学精品课程分析化学实验项目指导书 2达到相互分离.薄层色谱和柱色谱的吸附剂(固定相)有硅胶,氧化铝,硅藻土等无机物,也有糖类,纤维素,聚酰胺,C18 和离子交换树脂等有机物.它们的分离机理也各不相同,如吸附,分配,氢键,正相和反相色谱等。
对于纸色谱或薄层色谱,毛细管作用是推动溶剂展开的动力.被分离物质在图谱上的位置,可用比移值Rf表示Rf=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离。
植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源.在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用.高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a,叶绿素b,β胡萝卜素和叶黄素四种. 叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能.叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂.在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
三、实验装置四、实验操作步骤和内容：（一）步骤1、吸附剂的选择薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。
1）、硅胶：“硅胶H”—不含粘合剂；“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；其颗粒大小一般为260目以上。
颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而Rf 值较小。
酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代物、醚> 烯> 饱和烃本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G。
龙岩学院分析化学精品课程分析化学实验项目指导书 32、薄层板的制备（湿板的制备）薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。
薄层应尽量均匀且厚度要固定。
否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。
在烧杯中放入2g硅胶G，加入5—6ml 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。
将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。
本实验用此法制备薄层板4片。
3、薄层板的活化将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。
硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110℃活化30min。
氧化铝板在200℃烘4h可得到活性为Ⅱ级的薄板，在150—160℃烘4h可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。
活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
4、点样先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
若在同一板上点几个样，样点间距离应为1。
点样要轻，不可刺破薄层。
5、展开薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。
为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。
在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。
将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。
盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。
晾干，观察斑点位置，计算Rf值。
分离叶绿体色素的展开剂有:石油醚(60 ~ 90℃)-丙酮-乙醚(3:1:1);石油醚-丙酮(8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);苯-丙酮(7:3)和石油醚(30 ~ 60℃)-丙酮-正丁醇(90:10:4.5)等.本实验将150 mL石油醚(60 ~ 90℃)-丙酮-乙醚(3:1:1)展开剂倒入层析缸中,并在层析缸的内壁四周贴一张5 cm高的滤纸,滤纸下部浸在展开剂中,盖好盖子平衡10~15 min.将点好样的硅胶板放入展开缸里,液面不能超过点样线,盖好盖子进行上行层析.待展开剂前沿上升到距硅胶板上端 1.5~2 cm时,取出硅胶板置于通风橱里晾干,可看到层析板上出现若干色素带,其排列顺序一般是β-胡萝卜素,去镁叶绿素,叶绿素a,叶绿素 b 和叶黄素等多条色带.用铅笔标记出样品斑点,计算各色素的比移值Rf.6、显色被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。
如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。
还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧龙岩学院分析化学精品课程分析化学实验项目指导书 4光背景上呈暗色斑点。
本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。
7、样品收集将层析板上分开的β-胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b的色带分别用干净的刮刀刮入试管中,加入5 mL丙酮提取,低温避光保存.8*、温度对薄层色谱分离的影响取两块1×5 cm 2 的商品硅胶板,点样后,以相同的展开剂,分别置于冰箱(4℃)和室温(20℃以上)展开.观察和对比它们的分离结果.(二)实验内容：（以下实验内容选做其一）1、检验甲基橙的纯度。
（通过与已知标准物对比的方法检验物质是否纯净）实验样品：甲基橙粗品（自制）、甲基橙纯品。
溶剂：乙醇：水=1：1展开剂：丁醇：乙醇：水=10：1：12、混合物的分离实验样品：圆珠笔芯油溶剂：95%乙醇展开剂：丁醇：乙醇：水=9：3：1（体积比）3、1%偶氮苯、1%间硝基苯胺、荧光黄(95%乙醇, 1mg/1ml)、次甲基蓝、环己烷:乙酸9:14、植物色素β-胡萝卜素,去镁叶绿素,叶绿素a,叶绿素b和叶黄素的提取与分离。
五、实验关键步骤：1、载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在玻片上应均匀平整。
2、点样不能戳破薄层板面，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm。
3、展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。
否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。
六、思考题1、如何利用Rf 值来鉴定化合物？答：在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（Rf 值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
