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专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离1．下列试剂可用于血红蛋白释放的是()①0.9%的生理盐水②甲苯③磷酸缓冲液④蒸馏水⑤柠檬酸钠A．②④B．①④C．④⑤D．①③[解析]0.9%的生理盐水是洗涤红细胞是应用的试剂，不能用于血红蛋白释放；甲苯的作用是溶解细胞膜的磷脂，加速血红蛋白的释放；磷酸缓冲液用于粗分离蛋白质，不能用于释放血红蛋白；蒸馏水作用是使红细胞吸水胀破，释放其中的血红蛋白；柠檬酸钠的作用是采血时，防止血液凝固，不能用于血红蛋白的释放。
[答案]A2．在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散乱、变宽，与其有关的是()A．凝胶色谱柱的制作B．色谱柱的装填C．洗脱过程D．样品的处理[解析]在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散乱、变宽，说明色谱柱制作不成功，可能是凝胶装填不紧密、不均匀，或者存在气泡，打乱了洗脱次序所致。
[答案]B3．下列有关“血红蛋白提取和分离”实验的正确叙述是() A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D．整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构[解析]对红细胞洗涤时应该用生理盐水，不能用蒸馏水，A错误；将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，B错误；血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是溶解磷脂，加速血红蛋白的释放，C错误；整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持pH相对稳定，防止和血红蛋白的结构发生改变，D正确。
[答案]D4．凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1.6 cm，有关说法中，不正确的是()A．一般凝胶色谱柱直径的大小不会影响分离的效果B．凝胶色谱柱过高，超过1 m，不影响分离的效果C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大[解析]一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2 cm的色谱柱。
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、血红蛋白的简介血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
它存在于红细胞中，使血液呈现红色。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，其功能主要是将氧气从肺部输送到身体的各个组织，并将二氧化碳从组织带回肺部排出。
了解血红蛋白的结构和功能对于我们进行其提取和分离的研究具有重要意义。
二、血红蛋白提取和分离的原理1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
这样，相对分子质量不同的蛋白质就得以分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在一定的 pH 下，蛋白质分子会带上电荷，由于不同蛋白质分子所带电荷的性质和数量不同，以及分子大小不同，在电场中的迁移速度也就不同，从而实现蛋白质的分离。
三、血红蛋白提取和分离的实验材料和用具1、实验材料新鲜的血液（通常选用哺乳动物的血液，如猪、牛等）2、实验用具（1）色谱柱：用于凝胶色谱法分离血红蛋白。
（2）电泳装置：包括电泳槽、电源等，用于电泳分离。
（3）离心机：用于离心分离血细胞和血浆。
（4）透析袋：用于去除小分子杂质。
四、血红蛋白提取和分离的实验步骤1、样品处理（1）采集新鲜血液，加入柠檬酸钠防止血液凝固。
（2）低速短时间离心，将血液分为血浆和血细胞两部分。
（3）向血细胞中加入蒸馏水，使红细胞吸水涨破，释放出血红蛋白。
2、粗分离（1）将混合液高速长时间离心，除去细胞膜等杂质，得到血红蛋白溶液。
（2）将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析，以除去小分子杂质。
3、纯化（1）凝胶色谱操作装填凝胶色谱柱：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，避免出现气泡。
血红蛋白的分离和提取一、引言血红蛋白，这个听起来有点复杂的东西，实际上在我们的身体里扮演着超级重要的角色。
想象一下，血红蛋白就像是你体内的快递员，负责把氧气送到每一个细胞。
它的分离和提取其实并不简单，但却充满了乐趣和挑战。
1.1 血红蛋白的基础知识首先，血红蛋白是红细胞中的一种蛋白质。
它能和氧气结合，形成氧合血红蛋白。
这种结合不仅让我们的血液呈现出鲜艳的红色，也让我们的身体能够正常运转。
哦，还有，血红蛋白的结构非常独特，包含四个亚基，就像一把精致的钥匙，专门用来打开氧气的大门。
1.2 分离的意义那么，为什么我们要分离血红蛋白呢？其实，分离出来的血红蛋白在医学和生物研究中非常重要。
研究人员可以用它来开发新的治疗方法，帮助那些血液疾病患者。
分离血红蛋白，就像在大海捞针，但每一次成功的提取都能为科学进步添砖加瓦。
二、分离与提取的步骤血红蛋白的分离和提取有一系列步骤，听上去复杂，但其实挺简单。
2.1 准备材料首先，得准备好一些材料。
你需要新鲜的血液样本。
不要担心，这并不是你想象中的复杂实验室环境。
其实，家里的厨房也是一个不错的地方。
再加上一些离心机、缓冲液和过滤器，你就可以开始了。
2.2 离心分离接下来，利用离心机把血液分开。
把血液放进离心管，调整好转速，启动机器。
几分钟后，红细胞就会沉底，血浆则漂浮在上面。
嘿，这个过程有点像制作沙拉，轻轻一拌，食材就分开了。
2.3 提取血红蛋白然后，你需要小心地取出沉淀的红细胞。
用缓冲液洗涤几遍，把杂质去掉。
最后，把红细胞用超声波处理，释放出血红蛋白。
这时候，你能看到一团美丽的红色液体，简直像是液体的宝石。
三、血红蛋白的分析提取出来的血红蛋白并不是终点，而是一个新的起点。
3.1 纯度检测在分析之前，得先检查纯度。
使用电泳技术，可以准确地判断血红蛋白的质量。
电泳就像是在赛道上跑步，跑得快的就是纯度高的，慢的就要重新来过。
3.2 功能测试然后，进行功能测试。
通过与氧气的结合能力，来评估血红蛋白的实际效果。
专题五 课题3血红蛋白的提取和分离 一、基础知识 （一）血红蛋白提取与分离的依据 1. 2. 3. 4. 5. （二）原理 1．凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 具体过程：
A． 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。 B．（1） 混合物上柱； （2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外； （3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。 （4） 不同的蛋白质分子完全分开； （5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。 2．缓冲溶液 缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。 思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 3．电泳 （1）概念：电泳是指 。 （2）原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 ， 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。 两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。 4．蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。
凝胶颗粒 相对分子质量较小的蛋白质
相对分子质量较大的蛋白质
（1） （2） （3） （4） （5）
B A 多孔板 思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 5．样品处理 血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有 的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是 ，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。 血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。 6．凝胶色谱操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快 二、实验操作 1．样品处理 （1）红细胞的洗涤 ①目的：去除 ②方法： ，离心速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下（ 的红细胞液体倒入 再加入用 质量分数为0．9％的氯化钠溶液洗涤。 ⑤低速离心（低速短时间） ⑥重复4、5步骤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。 （2）血红蛋白的释放 加 到 体积，再加40％体积的 ，置于 上充分搅拌10分钟加速细胞破裂, 细胞破裂释放出血红蛋白． （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）： 甲苯层 第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体 第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体 第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层 （4）透析 2．凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： 。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 ① 固定：将色谱柱处置固定在支架上 ②装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 ③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（ ）高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分 12小时。 3）样品加入与洗脱 （1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。 （2）加透析样品 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的 ③样品渗入凝胶床： ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集 思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即 ；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的 ；最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 。 3．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 三 实验结果分析与评价 观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数 、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使 和 一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带 ，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 四、练一练
1、2019年1月10日，施一公教授研究团队在《科学》上报道了人源γ-分泌酶结合淀粉样前体蛋白（APP）的高分辨率冷冻电镜结构，揭
示了结合底物后γ-分泌酶发生的构象变化，并对这些构象变化的功能进行了生化研究，从而为研究与癌症以及阿尔兹海默症相关的特异性药物设计提供了重要的结构信息。回答下列问题： （1）该项研究进行时，需控制温度、酸碱度等条件，因为高温、过酸、过碱会使γ-分泌酶的___________遭到破坏，失去活性。 （2）根据蛋白质的各种特性，如蛋白质分子的____________、所带电荷的___________、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等，可用来分离不同种类蛋白质，从而得到γ-分泌酶。 （3）γ-分泌酶由4个跨膜蛋白亚基组成，分别为PS1、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。若对γ-分泌酶4个跨膜蛋白亚基进行分离、纯化及分子量测定，需采用_____________及电泳技术。前者是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量较__________（填“大”或“小”）的跨膜蛋白移动速度较慢。 （4）电泳是指_____________在电场的作用下发生迁移的过程。对γ-分泌酶的4个跨膜蛋白亚基进行分子量测定时，通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，该方法测定的结果只是____ ____的分子量。该电泳迁移率完全取决于相对分子量的大小，原因是________________。
2、．血红蛋白的提取与分离：
①将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水和甲苯，其中加入甲苯的目的是___ ________。 ②利用凝胶色谱法分离蛋白质，常选用血红蛋白为材料，其原因是_____________________，该方法的基本原理是根据______________ （蛋白质特性）而达到蛋白质分离，蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、__________ _____、 、 。 ③下图1是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是____________。如果红色区带__________________，说明色谱柱制作成功。
④一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如下图所示。由图可知携带者有2种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_____________________ 3、．请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答下列问题：
（1）将实验流程按先后顺序补充完整：________、_________。 （2）凝胶色谱法的基本原理是根据________________分离蛋白质。 （3）洗涤红细胞的目的是去除_____ ____，洗涤干净的标志是________________。为防止血液凝固，在采血容器中通常要预先加入___________。 （4）凝胶色谱操作结束后，需要用电泳来对蛋白质进行纯度鉴定，电泳利用了待分离样品中各种分子的 ____________的特性，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。 （5）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS ，从而使电泳的迁移率完全取决于分子的大小。 4．2019年1月，施一公教授的研究团队在《科学》上报道了人源-分泌酶底物淀粉样前体蛋白的冷冻电镜结构，为研制阿尔兹海默症（AD）
的治疗药物提供了重要的结构信息。临床发现，AD病人的脑组织中出现淀粉样斑块，它是由淀粉样前体蛋白被某些酶切割产生的短肽聚集而成，其中最关键的酶是-分泌酶，该酶由4条不同的肽链组成，编码其中某肽链的基因所发生的突变与AD相关。请回答： （1）根据酶的专一性可知，-分泌酶是一种___________________（填“蛋白酶” 或“淀粉酶”），其基本组成单位是_____________。 （2）若要分离-分泌酶，需考虑蛋白质的____________________、所带电荷的__________________ 、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等。________________法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。在该方法中，相对分子质量较____________（填 “大”或“小”）的蛋白质移动速度较慢。 （3）通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量，但此方法不能直接测得-分泌酶的分子量，原因是________________________________。
