课题3 血红蛋白的提取和分离
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课题3 血红蛋白的提取与分离核心知识要点1.蛋白质的分离方法(1)凝胶色谱法:①概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②原理:a .凝胶⎩⎪⎨⎪⎧ 形态:微小的多孔球体组成:大多数由多糖类化合物构成结构:内部有许多贯穿的通道b .分离的方法:(2)①概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
②原理:在一定的pH 下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③作用过程: 各种分子⎩⎪⎨⎪⎧⎭⎪⎬⎪⎫带电性质差异分子本身大小不同分子本身形状不同不同的迁移速度各种分子的分离 ④方法:常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
测定蛋白质分子量时通常使用SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.血红蛋白的提取(1)红细胞的洗涤①目的:去除杂蛋白。
②方法:采集的血样要及时分离红细胞,分离时采用低速短时间离心,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水稀释,再离心,重复洗涤三次,直至上清液中不再呈现黄色,表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放加蒸馏水(作用是使红细胞吸水涨破)到原血液的体积,再加40%体积的甲苯(作用是溶解细胞膜),充分搅拌,细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中,以2 000 r/min 的速度离心10 min 后,可以明显看到试管中的溶液分为4层。
②将试管中的液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体,即血红蛋白溶液。
3.血红蛋白的粗分离——透析(1)原理:透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。
(2)过程:取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12 h。
(3)目的:除去样品中相对分子质量较小的杂质。
课题3 血红蛋白的提取和分离一、学习目标:本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法,并了解色谱法,电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后学习运用这些技术打下基础。
二、重点:凝胶色谱法的原理和方法三、难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
第一课时【自主学习】阅读教材,完成以下填空一、凝胶色谱法1、概念:根据被分离蛋白质的的大小,利用具有网状结构的凝胶,来进行分离。
2、原理(1)大多数凝胶是由类化合物(如葡聚糖或琼脂糖)构成的小球体,内部有许多。
(2)当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程,移动速度,而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在移动,路程,移动速度,从而使不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液1、作用:在一定范围内,抵制的对溶液pH的影响,维持pH 。
2、配制:由种缓冲剂溶解于中配制而成,通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
【课堂探究】1、已知蛋白质混合液在通过凝胶色谱法进行分离时,被洗脱的先后顺序依次是A、B判断下列叙述的正误:(1)A的相对分子质量比B大(2)B容易进入凝胶内部的通道,路程长移动速度慢。
(3)A容易进入凝胶内部的通道,路程长移动速度快。
【自主学习】阅读教材,完成以下填空三、电泳1、概念:指在电场的作用下发生的过程。
2、原理:在一定的下,、等生物大分子的可解离基团会带上或,在的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
3、作用:电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同,使带电分子产生不同的,从而实现样品中的分离。
4、方法:常用的电泳方法有和。
测定蛋白质分子量时通常使用。
5、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带以及等因素。
6、SDS的作用原理:SDS能使蛋白质发生。
由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS 的作用下会解聚成,因此测定的结果只是的分子量。