血红蛋白的提取和分离
一.蛋白质分离的依据
蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。
二、凝胶色谱法
1.概念:也称做分配色谱法;是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
2.凝胶色谱法原理
(1)由多糖类化合物构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。
(2)当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。
(1)识图析图
图a,相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留;相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。
图b,①蛋白质混合物上柱; ②洗脱开始,相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内;相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外; ③相对分子质量较小的蛋白质被滞留,相对分子质量较大的蛋白质向下移动; ④相对分子质量不同的分子完全分开; ⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短,已从层析柱中洗脱出来,相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
三、缓冲溶液
1.作用:在一定范围内,缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。
2.配制:由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。
注意：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。
四、电泳
1.概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的
作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
4.方法:常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
相关知识：测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子的基本单位是氨基酸，氨基酸的一些基团在一定的pH下会发生水解或电离从而带有电荷。
但总的来说蛋白质分子一般带有负电。
在电场的作用下，带电的蛋白质分子会向着电泳槽中的正极方向移动。
由于样品中各种蛋白质分子净电荷的量的差异以及蛋白质分子本身的大小等因素，使蛋白质分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种蛋白质分子分离开。
由于蛋白质分子带电电荷比较复杂，净电荷总量与蛋白质分子的质量不成正比，而不同蛋白质分子的质量又是衡定的，电泳时在带电量和分子质量两种因素的作用下会产生迁移速率的复杂化，不能正确地将分子质量不同的蛋白质分子分离开.
因此，实际操作中，一般会将蛋白质分子与SDS（十二烷基硫酸钠）发生反应形成蛋白质—SDS复合物，由于SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使蛋白质的迁移率完全取决于蛋白质分子质量的大小。
在电场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢，离前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前沿较近。
这样，不同分子量大小的蛋白质得到了分离。
如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成前沿整齐、清晰的条带。
五、实验操作过程
（一）一般步骤：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
1.样品处理：
(1)红细胞的洗涤:反复加生理盐水并低速短时离心，去除上清液，直到上清液不呈现黄色为止。
①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。
②洗涤操作：
(2)血红蛋白的释放：
①目的：在蒸馏水和甲苯作用下，使红细胞破裂释放血红蛋白。
(蒸馏水是为了使红细胞吸水胀破；甲苯是为了溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与分离。
)
②过程：
(3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。
②目的：经过离心使血红蛋白和其它杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化
③试管中溶液层次：
搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如下图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。
第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）
第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）
第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）
第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）
④分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
2、血红蛋白的粗分离----透析：
①原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。
②过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l（按1:300的比例）的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
③目的：a一是除去样品中分子量较小的杂质。
b、二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。
3、分离纯化血红蛋白---凝胶色谱操作:
(1)凝胶色谱柱的制作
①取长40 cm,内径为1.6 cm的玻璃管,两端磨平。
②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100
目的尼龙纱包好。
③顶塞制作:插入安装了玻璃管的橡皮塞。
④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安接其他附属结构。
特别提醒：凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果,但直径过大造成洗脱
液体积大,样品稀释度大;凝胶色谱柱的高度与分离度有关。
(2)凝胶色谱柱的装填
①、凝胶的选择：
A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。
75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
②、填装过程
为了加快干凝胶的膨胀,可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至接近沸腾,通常只需1～2 h。
这种方法不但节约时间,而且可以除去凝胶中可能带有的微生物,排除胶粒内的空气。
注意事项：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
3、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。
4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（3）样品加入与洗脱
4.纯度鉴定
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量。
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。
此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
血红蛋白由四条肽链组成,包含两条α链和两条β链. 每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。
血红蛋白因含血红素而呈现红色。
六、操作提示
2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。
3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。
气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。
4.蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。
特别提醒：①红细胞洗涤过程中,洗涤三次后,上清液仍有黄色,可增加洗涤次数,否则无法除去血浆蛋白;离心时转速要低,时间要短,否则白细胞等会一同沉淀,达不到分离效果。
②血红蛋白释放过程中,蒸馏水的作用是使红细胞吸水涨破,甲苯的作用主要是溶解细胞膜。
③为了加快干凝胶的膨胀,可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至接近沸腾,通常只需1～2 h 。
这种方法不但节约时间,而且可以除去凝胶中可能带有的微生物,排除胶粒内的空气。
④滴加样品时,吸管管口要贴着管壁环绕移动,防止破坏凝胶面。
① ② ③ ④
缓冲液 样品 缓冲液 样品 样品 甲 乙 缓冲液 血红蛋白溶液
透
析
袋。
