重组酶聚合酶扩增技术的研究进展

重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》【年(卷),期】2019(041)010【总页数】4页(P1037-1040)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术; 快速检测; 鲤春病毒血症病毒【作者】梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【作者单位】烟台海关技术中心山东烟台 264000【正文语种】中文【中图分类】S852.65鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属水泡病毒属(Vesiculovirus)，是一种弹状病毒[1]，主要流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年蔓延至美洲和亚洲[2-4]。

SVCV 宿主范围非常广泛，四大淡水鱼类均能被感染，其中最易感的为鲤科鱼类，尤其仔鱼，一旦感染死亡率可达70 %[5]。

它可以引起鱼类大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)，是世界动物卫生组织(OIE)必须通报的动物疾病。

SVCV 传统的检测方法是细胞培养分离法，但该方法费时费力。

近年来检测SVCV 的分子生物学方法被广泛研究并应用。

其中重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymerase amplification，RPA)方法可以在25 ℃～42 ℃恒温条件下20 min内快速完成核酸扩增，无需昂贵的变温仪器，反应迅速，灵敏度高，扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测[6-8]，适合现场快速检测。

本研究依据SVCV G 基因保守序列设计特异性引物，利用RPA 技术建立一种简便高效、特异性强、灵敏度高的SVCV 检测方法，适用于设备简单的基层实验室及现场检测，是SVCV日常监控及检测的有效手段。

1 材料与方法1.1 主要实验材料 SVCV 由本实验室保存。

传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)和传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)均由深圳出入境检验检疫局提供。

五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【摘要】目的建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.%Objective To establish a one-step recombinase polymerase amplification (RPA) method for pathogen screening and rapid detection in the field targeting for five hemorrhagic fever related viruses (Zaire ebola virus, Sudan ebola virus, Marburg virus, Lassa virus and Yellow fever virus). Methods The specific nucleic acid (NA) fragments of each virus were selected as target genes by genome sequence analysis, and the primers and probes for RPA assays were designed according to the sequence. A series of diluted template genes were used for RPA detection to determine the sensitivity. The hemorrhagic fever-related viral nucleic acids were used for RPA detection to determine the specificity. The amplification experiments were carried out at di fferent temperature ranging from 37℃ to 42℃ to validate thereaction temperature range. Results The RPA reaction systems of the five hemorrhagic fever viruses could effectively amplify the target genes, the sensitivities were between 1.5×102 and 1.5×103 co pies. No cross reactions existed with the other hemorrhagic fever-related viral genes. Meanwhile, RPA assay could effectively amplify the target genes at 37-42℃. Conclusion The isothermal RPA assays of five hemorrhagic fever viruses are established, which may amply target genes fast and react at a wide temperature range, and be potentially useful for in field pathogens detection.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)006【总页数】6页(P526-531)【关键词】重组酶聚合酶检测;等温扩增;出血热病毒【作者】曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【作者单位】230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.3埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)、拉沙病毒(Lassa virus，LASV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)均为烈性出血热病毒，主要流行于非洲，均可引起严重的出血热症状，感染率和致死率很高。

《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言DNA聚合酶是分子生物学领域中至关重要的酶类，其作用在于催化DNA链的合成。

Taq DNA聚合酶因其高活性、高保真性和在高温下的稳定性，在PCR（聚合酶链式反应）技术中占据重要地位。

然而，为了提高PCR的效率和准确性，进一步增强Taq DNA聚合酶的活性显得尤为重要。

本文旨在探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究。

二、重组蛋白技术概述重组蛋白技术是一种通过基因工程手段，将特定基因在体外进行克隆、表达、纯化和修饰，从而获得所需蛋白质的技术。

此技术可实现对蛋白质的精确操控，包括改变蛋白质的结构、功能和稳定性等。

在生物医学、生物技术和生物工业等领域，重组蛋白技术都有着广泛的应用。

三、Taq DNA聚合酶的活性提升策略为了提高Taq DNA聚合酶的活性，本研究采用重组蛋白技术，通过以下策略进行：1. 基因克隆与表达：首先，对Taq DNA聚合酶的基因进行克隆，并构建高效表达载体。

通过优化表达条件，如温度、pH值和诱导剂浓度等，实现Taq DNA聚合酶的高效表达。

2. 蛋白质纯化与修饰：采用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等纯化方法，对表达的Taq DNA聚合酶进行纯化。

此外，通过定点突变、糖基化等蛋白质修饰手段，提高Taq DNA聚合酶的稳定性和活性。

3. 酶活性评估：采用PCR实验，对纯化后的Taq DNA聚合酶进行活性评估。

通过比较不同条件下酶的活性，筛选出最佳的表达和纯化条件。

四、实验结果与分析1. 基因克隆与表达：成功克隆了Taq DNA聚合酶的基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达。

通过优化表达条件，Taq DNA聚合酶的表达量得到了显著提高。

2. 蛋白质纯化与修饰：采用多种纯化方法，成功纯化了Taq DNA聚合酶。

通过定点突变和糖基化等修饰手段，进一步提高了酶的稳定性和活性。

3. 酶活性评估：在PCR实验中，发现经过优化后的Taq DNA聚合酶活性得到了显著提高。

重组酶聚合酶扩增技术（PCR）作为一种在分子生物学领域应用广泛的技术，已经在科学研究、医学诊断、法医学和环境监测等领域发挥着不可替代的作用。

随着科学技术的不断进步和发展，PCR技术也在不断地演变和改进。

本文将就重组酶聚合酶扩增技术的发展趋势进行探讨，分析未来可能的发展方向和应用前景。

一、新一代PCR技术的出现随着生物技术领域的快速发展，新一代PCR技术不断涌现。

数字PCR 技术的出现，可以实现对DNA的绝对定量，有望广泛应用于癌症早期诊断和评估、胚胎植入前诊断等领域。

环介导等温扩增技术的兴起，使得PCR技术的使用更加简便和快速，有望在临床快速诊断中得到广泛应用。

二、PCR技术与人工智能的结合随着人工智能技术的快速发展，PCR技术也将不可避免地与人工智能技术结合。

人工智能可以帮助分析PCR实验的大量数据，寻找数据之间的关联，加快实验结果的解读和分析。

人工智能还可以在PCR实验设计阶段提供智能化的建议和优化方案，提高PCR技术的效率和准确性。

三、微流控技术在PCR中的应用微流控技术是近年来分析化学领域的一个热点，该技术可以在微型芯片上实现对样品的稀释、混合、加热等一系列操作，结合PCR技术，可以实现对DNA的快速扩增和检测。

微流控技术的应用有望将PCR技术推向微型化、智能化和自动化的方向，提高PCR技术的高通量分析能力。

四、CRISPR技术与PCR的结合CRISPR技术作为一种精准的基因编辑技术，与PCR技术的结合有望在基因诊断和基因治疗领域发挥重要作用。

利用PCR技术快速扩增基因片段，然后结合CRISPR技术对特定基因进行精准编辑，可以为许多遗传病的治疗提供新的思路和方法。

五、PCR技术在环境监测中的应用PCR技术在环境监测中的应用也是一个备受关注的领域。

利用PCR技术可以快速检测水体中的致病微生物和污染物，为环境保护提供重要的技术支持。

未来，随着PCR技术的不断改进和完善，其在环境监测中的应用前景将更加广阔。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌1. 引言1.1 背景介绍创伤弧菌是一种常见的致病菌，主要存在于海水和淡水中，同时也可在生鲜水产品中被检测到。

感染创伤弧菌会引起人类和动物的创伤性疾病，严重时可能导致败血症和坏死性皮肤病等严重后果。

由于其耐热性和抗生物药性强，创伤弧菌在临床和食品安全领域的监测和控制备受关注。

传统的创伤弧菌检测方法存在着操作复杂、耗时长、灵敏度低等问题，难以满足迅速准确的检测需求。

开发一种快速、灵敏、简便的检测技术对于创伤弧菌的监测具有重要意义。

1.2 研究目的本研究旨在探讨重组酶聚合酶扩增技术（RPA）在创伤弧菌检测中的应用，并分析其在该领域中的优势和局限性。

创伤弧菌是一种常见的致病菌，经常引起食物中毒和水污染等问题，对人类健康构成威胁。

通过研究RPA技术在创伤弧菌检测中的表现，我们希望能够为提高创伤弧菌的快速、准确检测水平提供科学依据。

我们还将探讨RPA技术在创伤弧菌检测中的前景，并提出未来研究方向，为该领域的发展提供参考和指导。

本研究旨在为解决创伤弧菌检测中存在的问题，保障食品安全和公共健康做出贡献。

2. 正文2.1 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)原理重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的核酸扩增技术，其原理基于同源重组DNA修复机制。

该技术利用特殊的重组酶在等温条件下介导两个互补的引物与靶序列结合，形成DNA双链，然后通过DNA聚合酶的作用在靶序列上合成新的DNA链，实现核酸扩增。

RPA在温度较低(37-42摄氏度)下运行，不需要复杂的仪器和设备，使其成为一种便携式的核酸扩增技术。

RPA技术的原理是基于同源重组原理，依赖于专一性的重组酶和DNA结合蛋白，实现引物与靶序列的结合和合成新的DNA链。

这种技术可以在短时间内完成核酸扩增，且具有高敏感性和特异性，能够在复杂的样品中准确检测目标DNA。

RPA技术的原理简单而高效，为快速检测创伤弧菌提供了新的可能。

通过结合RPA技术与其他技术的优势，可以更快速、更可靠地检测创伤弧菌，为预防传染病提供有力支持。

重组酶介导的核酸快速扩增法摘要：体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术。

重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。

RAA 法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶代替了传统PCR 的热循环解链过程, 实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR 反应。

Abstract:Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.关键词：重组酶体外核酸扩增在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展[1]，如SDA技术、TM A技术、HDA技术、LAMP技术和RPA／RAA技术等。

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用秦立得;南文龙;陈义平【摘要】重组酶聚合酶扩增技术是近年来建立起的一种常温DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、所需仪器简单等优点.本文介绍了该技术的检测原理、引物及探针设计和影响因素,分析了该技术在动物病毒病检测方面的应用,指出该技术具有良好的现场快速检测与多重及大量样品检测的应用前景.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2017(034)005【总页数】5页(P81-85)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术;动物病毒病;研究进展;展望【作者】秦立得;南文龙;陈义平【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S851.342006年，Olaf Piepenburg等[1]报道发明了重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplifi cation，RPA）。

该技术可在37～42 ℃条件下、10～20 min内等温扩增目的基因片段。

随后，英国TwistDx公司开发出了商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。

与聚合酶链式反应（PCR）相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单（甚至可制作成侧流层析试纸条）等优点，特别适用于快速检测。

目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。

在目的DNA片段扩增的过程中，引物与uvsX重组酶形成的复合物与DNA结合并沿DNA链寻找引物的同源序列，完成定位后发生链交换反应并打开2条DNA单链间的氢键，单链绑定蛋白（SSB）与单链DNA链结合，阻止形成双链，之后Bsu聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制DNA；同时反应体系中含有uvsY 酶，能与uvsX结合并促进uvsX与单链DNA更加紧密的结合，以发生链交换反应，如此循环，从而完成了对目的DNA片段的扩增（图1）。

英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。

这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。

RPA技术特点常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。

RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。

这无疑能大大加快PCR的速度。

此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。

而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。

不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。

目前，TwistAmp® 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。

不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），甚至在更低的温度下进行反应。

RPA技术原理首先重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列。

然后一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。

被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。

在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。

整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，只要准备好引物和模板就行。

一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增(RT-RPA)技术检测菜豆荚斑驳病毒张永江;魏霜;袁俊杰;乾义柯;李桂芬;魏梅生【摘要】菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,简称BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物,建立快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,简称RT-RPA)技术用于对BPMV的检测.根据BPMV基因组的保守序列,设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)技术特异性引物,对BPMV、南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,简称SBMV)、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,简称SMV)、南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,简称ArMV)及烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,简称TRSV)共5种病毒进行RT-RPA特异性验证;并设计5个模板浓度梯度,以验证RT-RPA方法的灵敏性.结果表明,建立的RT-RPA检测方法能够从BPMV样品中检测到198 bp的特异性条带,且仅需在40℃下恒温反应40 min,不需要特殊的仪器设备;特异性验证试验表明,除BPMV能检测到特异性条带外,其他4种病毒SBMV、SMV、ArMV、TRSV均未检测到特异性条带,证明该方法特异性好;RT-RPA检测BPMV的灵敏度达到10-4稀释度,说明所建立的RT-RPA方法灵敏性高.综上所述,建立的RT-RPA方法检测BPMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2018(046)021【总页数】3页(P96-98)【关键词】菜豆荚斑驳病毒;RT-RPA检测;植物检疫【作者】张永江;魏霜;袁俊杰;乾义柯;李桂芬;魏梅生【作者单位】中国检验检疫科学研究院,北京 100176;广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东广州510632;湛江出入境检验检疫局,广东湛江524000;伊犁出入境检验检疫局,新疆伊宁835221;中国检验检疫科学研究院,北京 100176;中国检验检疫科学研究院,北京 100176【正文语种】中文【中图分类】Q78菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus，简称BPMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)豇豆花叶病毒属(Comovirus)，其自然寄主为大豆、豇豆、菜豆等豆科植物，实验寄主多达20属25种；分布广泛，在巴西、加拿大、美国、厄瓜多尔、秘鲁等大豆产区均发现其危害[1-5]。