实验名称木薯酒精发酵院系生物与化学工程学院专业生物工程班级生物121学号201200606029姓名翁振耀指导老师赵东玲二〇一五年七月十二日目录1 绪论 (1)1.1 实验目的 (1)1.2 实验原理 (1)2 材料与方法 (2)2.1 实验材料 (2)2.1.1菌种 (2)2.1.2 培养基 (2)2.1.3 主要药品与试剂 (2)2.1.4主要仪器设备 (3)2.1.5其他辅助仪器 (3)2.2 方法与步骤 (4)2.2.1试剂配制 (4)2.2.2培养基配制 (4)2.2.3酿酒酵母GGSF16培养 (5)2.2.4分析方法 (5)3 实验记录与计算 (7)3.1 记录发酵时间流程 (7)3.2 称重数据 (7)3.3 计算方法 (9)3.3.1还原糖的计算 (9)3.3.2 总糖的计算 (10)3.3.3测酒精度 (11)3.3.4发酵效果的判定指标 (11)4 结果与讨论 (11)4.1 结果 (11)4.1.1计算结果 (11)4.1.2发酵效果指标 (12)4.1.3 CO2失重作图 (12)4.2讨论 (12)4.2.1 结果讨论 (12)4.2.2 误差分析 (12)4.2.3 实验收获 (13)致谢 (13)参考文献 (14)附录 (14)1 绪论1.1 实验目的1. 掌握木薯淀粉液化、糖化原理。
2. 掌握酒精发酵的基本原理。
3. 掌握总糖、还原糖及酒度的测定原理和方法。
1.2 实验原理酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。
酒精发酵的类型有3种：即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵[4]。
酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下，丙酮酸则继续分解为乙醇。
如果在碱性条件或者培养基中加有亚硫酸盐时，则发酵的主要产物是甘油，这也是工业的甘油发酵。
因此，如果要用酵母进行酒精发酵，就必须控制发酵液的微酸性条件。
2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF162.1.2 培养基（1）YPD液体培养基：用于种子培养。
（2）木薯粉发酵培养基：用于酵母发酵。
2.1.3 主要药品与试剂表2-1 主要药品与试剂Table 2-1 Main chemicals and reagents产品名称规格产地/厂家葡萄糖AR 天津市科密欧化学试剂有限公司酵母浸膏BR 广东环凯微生物科技有限公司细菌学蛋白胨BR 广东环凯微生物科技有限公司磷酸二氢钾AR 广东光华化工厂有限公司无水氯化钙AR 广东汕头市西陇化工厂氯化铵AR 广东光华化学厂有限公司七水硫酸镁AR 广东台山粤侨试剂塑料有限公司氢氧化钠AR 广州化学药剂厂盐酸AR 广东汕头市西陇化工股份有限公司硫酸AR 广东汕头市西陇化工股份有限公司酒石酸钾（C4H4O6KNa·4H2O）AR 天津市大茂化学试剂厂硫酸铜(CuSO4·5H2O) AR 天津市大茂化学试剂厂亚甲基（C16H18ClN3S·3H2O）AR 天津市科密欧化学试剂有限公司表2-2 酶制剂Table 2-2 Enzyme preparation酶制剂规格液化酶40000 U/mL糖化酶100000 U/mL2.1.4主要仪器设备表2-3 主要仪器设备Table2- 3 Main instruments and equipments仪器名称规格产地/厂家恒温培养振荡器ZHWY-2112C 上海智城分析仪器制造有限公司电子天平T－500 美国双杰兄弟（集团）有限公司全温度恒温调速摇床柜HWY-2112 上海智城分析仪器制造有限公司电子天平JJ200 常熟市双杰测试仪器厂电子分析天平AB104－N 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司酒精浓度计MC 冀州市耀华器械仪表厂全自动新型鼓风干燥箱ZFD－5230 上海智城分析仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌器LS-B35L-I 江阴滨江医疗设备有限公司立式压力蒸汽消毒器628B-2 铁岭市医疗器械总厂不锈钢电热蒸馏水器15KW－20L 上海博讯实业有限公司医疗设备厂光波炉YS－A007B 广东省茂名市亚洲电器有限公司垂直流超净工作台2HJH-1112C 上海智城分析仪器制造有限公司2.1.5其他辅助仪器（1）40目筛：筛木薯粉（2）纱布及脱脂棉：总糖测定发酵液预处理过滤用及还原糖测定过滤（3）500mL三角瓶：20个（包扎灭菌），用于发酵（4）纱布及牛皮纸、保鲜膜：用于三角瓶包扎（5）200mL量筒：2个，要包好灭菌，用于分装发酵培养基（一用一备）（6）玻璃棒：2根，包好灭菌，用于调发酵液pH值（一用一备）（7）200mL烧杯：2个，包好灭菌，用于分装发酵培养基（一用一备）（8）100mL量筒：2个，用于量取发酵液，收集酒精（9）酒精计：一个，规格0-10%，用完要用水洗好，擦干（10）水银温度计：测酒精时量温度，用完要用水洗好（11）250mL三角瓶：4个，用于总糖消化和测还原糖（12）105cm回流管：带塞（13）电炉：用于滴糖加热（14）pH试纸：用于测发酵培养基pH(4.5)值，测总糖调pH(微酸性)（15）电子天平：规格0-500克，用于测摇瓶总重（二氧化碳失重）（16）精馏装置：包括500mL精馏瓶，用于酒精测定（17）250mL容量瓶：用于总糖及还原糖测定的试样制备（18）5L 三角瓶:一个，木薯粉液化和糖化（19）注射器及过滤除菌膜（20）25mL滴定管2.2 方法与步骤2.2.1试剂配制（1）2.5g/L的标准葡萄糖溶液：配取3L，分三次配，每次配1L。
先称取20.0g瓶装葡萄糖放入称量瓶内于105℃烘4h后，置于干燥器中冷却，再分三次称量，每次准确称取烘干样品2.5000g于小烧杯中，加适量水溶解，再加5mL浓盐酸，搅拌混匀后引流，加水定容至1000mL。
再重复配两次。
（提前2-3天配好备用。
）（2）NH4Cl：使用时终浓度为0.6g/L。
称取1.8g NH4Cl固体，用适量无菌水溶解后，在超净台中用注射器和过滤膜操作，将溶解液过滤除菌待用。
（3）菲林甲液：配3L，分三次配制，每次配1L。
每次称取69.3g硫酸铜（含5个结晶水）加蒸馏水定容至1000mL。
再重复配两次。
（4）菲林乙液：配3L，分三次配制，每次配1L。
每次称346.0g酒石酸钾钠加100.0g 氢氧化钠，混溶于适量蒸馏水后，加蒸馏水定容至1000mL。
再重复配两次。
（5）质量分数为20%的HCl溶液(总糖的测定-消化)：量取36%-38%浓盐酸556.0mL于1L 容量瓶，加蒸馏水定容至1000mL。
（6）2mol/L H2SO4溶液(调发酵液pH)：吸取浓硫酸（18M）11.1mL缓慢加入装有适量水的小烧杯中，冷却后引流到100mL容量瓶，加蒸馏水定容至100mL。
（7）200g/L NaOH溶液(总糖的测定-消化)：称取100.0g氢氧化钠于小烧杯中溶解，引流到500mL容量瓶，加蒸馏水定容到500mL。
（8）2mol/L NaOH溶液(酒精度测定)：称取8.0g氢氧化钠于小烧杯中溶解，引流到100mL 容量瓶，加蒸馏水定容到100mL。
（9）亚甲基兰溶液（1%，w/v）: 称取 1.0g亚甲基蓝，在小烧杯中加水溶解，引流到100mL容量瓶并定容至100mL。
2.2.2培养基配制（1）YPD液体培养基：配制500mL。
称取：葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白胨5g，三者混合煮溶解后定容到500mL。
自然pH，分装到三个250mL三角瓶（每瓶150mL）和4支试管（每支5mL）。
115℃灭菌20min。
（2）YPD Agar:量取50mL液体YPD，加入1g琼脂，混合后装入100mL三角瓶，115℃灭菌20min。
冷却到适合温度后趁热倒试管斜面。
（3）木薯粉发酵培养基：称取过40目筛的木薯粉429.6g加入5L三角瓶，以料水比1：3的比例混合于60℃的自来水中，添加相应营养盐为MgSO4·7H2O 1.35g，KH2PO4 4.5g，CaCl20.6g，调浆定容到3L, 按10U/g木薯粉的量加入液化酶，搅拌混匀后60℃下保温30min糊化，然后迅速升温到97℃，保温液化1.5h后，115℃灭菌30min.冷却到室温（30℃左右），添加过滤除菌的NH4Cl全部溶液（用1.8g固体NH4Cl配成），摇匀，滴加2mol/L H2SO4调pH至4.5，按150U/g木薯粉加入糖化酶。
搅拌均匀后，取发酵液60mL置于三角瓶中分别取样测定初总糖和初还原糖。
2.2.3酿酒酵母GGSF16培养酵母菌种培养流程：实验室保藏菌种→斜面活化→一级种子培养→二级种子培养→接种发酵（1）斜面活化：无菌操作将实验室保存的酵母GGSF16接种到斜面培养基上，32℃培养1d-2d。
（2）一级种子培养：挑取活化后健壮的菌种取一环，接种（二级种子接种前8-10小时接）到液体试管培养基中，32℃培养。
（3）二级种子培养：（接种发酵液前8小时）将一级种子按体积比1%接种到三角瓶中。
（4）接种发酵：按接种量为10％，接种酿酒酵母GGSF16至液化糖化后的木薯培养基中。
搅拌混匀后分装到19个500mL三角瓶。
每瓶加150mL，用透气膜、保鲜膜封口，第一次称重，于33℃，转速为120r/min，摇床培养24h，培养期间定时间隔称重。
发酵结束后，测定酒精度，残总糖和残还原糖。
2.2.4分析方法（1）还原糖的测定[3]①试样的制备：称取木薯发酵液试样10mL于250mL容量瓶定容至250mL，用纱布夹脱脂棉过滤，滤液摇匀备用。
②斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定A.预备试验：分别吸取费林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶内，加20mL蒸馏水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰溶液（1%，w/v）2滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。
记录标准葡萄糖液消耗的总体积。
B.正式试验：吸取费林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶内，加水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，加入玻璃珠数颗，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min内以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。
记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL 之内。
③试样还原糖的测定A.预备试验：吸取费林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶内，加20mL水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰溶液2滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。
