酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验

固定化酵母细胞生产乙醇试验报告
本试验旨在研究固定化酵母细胞生产乙醇的能力。

首先，采用分子生物学技术建立的固定化酵母细胞，并放入含有目标表达蛋白（乙醇脱氢酶）的受体体系，培养在适宜的培养基中；其次，添加有机底物和生长调节剂，提高酵母细胞乙醇合成效率；最后，在培养基不同时间段进行调控，观察乙醇液位高度，测量乙醇密度，确定乙醇比重指数及分子量。

试验结果表明，固定化酵母细胞在此培养条件下能够有效合成乙醇，乙醇的比重指数和分子量也有所提高，但乙醇的曲线变化显示出较弱的合成趋势，需要进一步调整培养参数，以提高乙醇的产率。

酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。

二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。

本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。

（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。

即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。

微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。

本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。

三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。

2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。

3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。

（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。

4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。

③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。

酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。

二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。

多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。

在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。

因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。

三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。

分装三角瓶；试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。

4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。

四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。

2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。

3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。

4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。

5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。

实验一固定化酵母酒精发酵一、实验目的掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。

掌握固定化酵母酒精发酵工艺。

掌握酒精的提取及测定方法。

二、实验原理固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。

它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。

由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。

一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。

细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。

若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。

微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。

选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。

微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1．吸附法吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。

（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。

（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。

吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。

2．包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。

细胞和载体不起任何结合反应．细胞处于最佳生理状态。

浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。

实验一酵母细胞的固定化一、实验原理与目的原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法,化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。

常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。

本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。

目的:了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作.二、仪器与用具仪器:50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱.化学材料：活化酵母菌(酵母悬液)、蒸馏水、无水CaCl2、海藻酸钠、葡萄糖。

三、试剂配制1、0.05mol/L的CaCl2溶液150ml；2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状；3、10％葡萄糖溶液150ml。

四、实验方法与步骤1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞,用玻璃棒充分搅拌混合均匀。

3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。

将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。

4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2～3次，然后加入装有150ml10％葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h,观察结果。

实验开始时，凝胶球是沉在烧杯底部,24h后，凝胶球浮在溶液悬浮在上层,而且可以观察到凝胶球并不断产生气泡，说明固定化的酵母细胞正在利用溶液中的葡萄糖产生酒精和二氧化碳,结果凝胶球内包含的二氧化碳气泡使凝胶球悬浮于溶液上层.五、结果观察：打开瓶盖，闻气味,观察葡萄糖液中的变化。

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采用物理或化学的方法固定微生物细胞， 以微生物在固定化后的生长状态可分为3类：固 定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞。
最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因 为多数微生物代谢的产物与其生长相关。
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微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）不用载体法。
包埋法
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包埋法
是制备固定化细胞最常用的方法。将生成 菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、 琼脂、海藻酸、卡拉胶、醋酸纤维、胶原、明 胶等包埋起来，发挥微生物的作用。
胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，
形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小
孔中，制成固定化细胞。
学生也可以经查阅资料自行设计酵母
细胞的固定化方法。
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三实验仪器、试剂
1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母，或新鲜的斜面酵母菌种。 2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL（海藻酸钠比较难溶，配制时需在加热
钾 0.1%，硫酸铵 0.2%，调节 pH5.0。（每组150mL装三角瓶，灭菌 后备用）
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四、操作步骤
1.干酵母活化：称取2g活性干酵母，投入50mL、2%蔗糖
溶液中，在32℃条件下活化1~2h；然后离心弃去上清液
（3000r/min、10min），备用。 2.固定化：将离心收集的酵母湿细胞悬浮在40mL海藻酸
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吸附法
最常用的是 物理吸附法：是将微生物细胞附着于 固体载体上的一种固定方法。常用的载体为多孔砖、瓷 杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。
例如：将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每g载体可
以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应
柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。 物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量 大，但细胞极容易脱落而流失，有待于进一步改善。

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。

将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。

用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。

并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。

采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。

关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。

实验二酵母细胞固定化及乙醇发酵一、实验目的要求1、掌握微生物细胞固定化的原理和基本技术2、学习酵母乙醇发酵过程二、实验原理（一）固定化细胞（immobilized cell ）固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。

近十余年来生物工程研究的重点领域之一；固定化细胞与固定化酶技术一起组成了现代的固定化生物催化剂技术。

优点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作，可大大提高生产能力。

应用：已涉及到食品、化学、医药、化学分析、环境保护、能源开发等领域。

用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理；用于制造微生物传感器（二）制备方法：吸附法；包埋法；共价结合法；交联法；1、吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部；简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落2、包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。

凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。

简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。

3、共价结合法：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而形成为固定化细胞。

细胞与载体结合紧密，不易脱落；但制备较难，且活力损失较大。

4、交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。

此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。

（三）载体多糖类：纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素等蛋白质：骨胶原、明胶等无机载体：氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等合成载体：聚丙稀酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点。

课题3 酵母细胞的固定化学习目标：1.说出固定化酶的作用和原理。

(重点) 2.尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

(难点)1．固定化酶的应用实例——生产高果糖浆 (1)反应原理：葡萄糖――――――――→葡萄糖异构酶果糖。

(2)生产原理：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装入反应柱中，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。

酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液可以自由出入。

(3)生产操作：①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。

②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。

③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。

(4)固定化酶的优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。

2．固定化酶和固定化细胞技术(1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

(2)常用方法[连线]：①－c－Ⅰ②－b－Ⅰ③－a－Ⅱ(3)载体：包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。

3．固定化酵母细胞的实验操作配制CaCl2溶液海藻酸钠溶液与酵母细胞混合↓固定化酵母细胞(1)活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。

(2)配制海藻酸钠溶液时，要使用小火或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。

(3)溶化好的海藻酸钠溶液要先冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞。

(4)在CaCl2溶液中形成的凝胶珠需在CaCl2溶液中浸泡30 min左右。

1．判断对错(1)从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小。

()(2)作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药。

()(3)尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用。

()(4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌。

()提示：(1)√(2)√(3)×尿糖试纸是一种酶试纸，是将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色化合物固定在纸条上，制成测试尿糖含量的酶试纸，这种酶试纸与尿液相遇时，很快会因为尿液中葡萄糖含量的多少而呈现一定的颜色，再次使用时颜色会有掩盖作用，所以不能反复利用。

酵母细胞的固定化技术学习目标：1.简述固定化酶、固定化细胞的应用、原理和意义；2.说出制备固定化酶、固定化细胞的一般方法；3.尝试用包埋法制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行发酵。

课前导学：一、固定化酶技术的应用1．固定化酶：是指用物理学或化学的方法将___________与_______________结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。

2. 制备固定化酶的方法主要有：______________、交联法、______________等。

二、固定化细胞技术1．固定化细胞：通过各种方法将________与_________结合，使细胞仍保持原有的生物活性。

2. 固定化细胞的方法：吸附法和两大类。

3．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点比较(一)制备固定化酵母细胞1．活化酵母细胞：活化就是处于________状态的微生物重新恢复正常的生活状态。

2．配制CaCl2溶液：3．配制海藻酸钠溶液：溶解海藻酸钠，最好采用酒精灯的方法，直至海藻酸钠完全融化。

如果加热太快，海藻酸钠会发生。

4．海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合：一定要将溶化好的海藻酸钠溶液________，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器。

5．固定化酵母细胞：以的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，逐渐形成凝胶珠。

(二)用固定化酵母细胞发酵1．制备麦芽汁：2．将固定好的酵母细胞用冲洗2-3次。

3．将固定好的酵母细胞凝胶珠加入无菌麦芽汁中，温度为℃。

（三）实验结果的观察：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。

质疑讨论：1．在固定化酶时，一般宜采用什么方法？固定化细胞时，又适宜采用什么方法？2．海藻酸钠溶液的浓度对实验有什么影响？3．怎么判断凝胶珠制作是否成功？例题精讲：1．固定化酶的优点是 ( ) A．有利于增加酶的活性 B．有利于产物的纯化C．有利于提高反应速度 D．有利于酶发挥作用2．酶的固定化常用的方式不包括 ( ) A．吸附 B．包埋 C．连接D．将酶加工成固体3．固定化细胞常用包埋法而不用吸附法固定化，原因是 ( ) A．包埋法固定化操作最简便 B．包埋法对酶的活性影响最小C．包埋法固定化具有普遍性D．细胞体积大，难以吸附或结合4．如下步骤是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞（1）在状态下，微生物处于休眠状态。

本实验载体的特点
材料 海藻酸钠凝胶 原理 优点 缺点 抗微生物分解能力弱， 机械强度较低（在高浓 度的单价金属离子和磷 酸盐缓冲液的作用下， 凝胶结构会破坏） 海藻酸钠是一种天然高分子多糖， 操作方便，毒 能够于Ca2+螯合形成不溶于水的 性小， 海藻酸钙凝胶。 调节海藻酸钠溶液的浓度可改变 固定化颗粒的机械强度和传质阻 力， 调节CaCl2溶液浓度可改变固定 化颗粒的机械强度。
三、材料和方法
• • • • • • • • （一）材料 1.菌种：酒精酵母（Saccharomyces erevisiae) . Rasses Ⅶ 2.海藻酸钠 3.淀粉水解糖液（10·BX）。 4.其他：注射器、针头、波美计等。 （二）培养基 1.斜面培养基：麦芽汁琼脂斜面 2.酵母细胞培养基 ：葡萄糖 20g,蛋白胨2g，酵母膏2g，硫酸镁0.05g ,自 来水1000毫升，pH5.0。 • 3.固定化酵母增殖培养基：葡萄糖50g, 蔗糖50g, 酵母膏2g, 蛋白胨3g, 硫酸二氢钾1.5g, 氯化铵1.5g, 硫酸镁0.5g, 二氯化锰0.02g, 含水氯化钙 5g, 自来水1000ml, pH5.0. • 4.乙醇发酵培养基：10 ·BX 淀粉水解糖液, 尿素0.2%, 磷酸二氢钾0.01%, pH 5.0.
包埋法载体的选择
• 包埋法较适合于固定化生长态的细胞，细胞可在凝胶网格或微囊中生 长繁殖，细胞大多聚集在载体内表面，提高了细胞密度、减少了传质 阻力。 但由于活细胞生长代谢，载体会受到物理、生物破坏。 • 要求：1、有一定的机械强度； 要求： 2、对酶、微生物、酸碱有耐受力； 3、固定化过程尽量温和，避免酶、细胞损伤； 4、凝胶网格通透性好，其孔径可调节； 5、廉价易得，无毒。 • 常用的载体：天然高聚物——卡拉胶、海藻酸钙、醋酸纤维素酯等； 常用的载体： 合成高聚物——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。

（包埋二法）是指固将定微生化物酶的技细胞术均和匀包固埋定在不化溶细于胞水的技多术孔性
载体中
化概学结念合：法利是指用将物酶分理子或或细化胞学相方互结法合将或将酶其或结合 到细载体胞上固定在一定空间的技术。
物理吸附法是指将酶吸附到包固埋体吸法附剂的表固或适 固面定者用 定化固于 化酶定细化胞细
化学
胞分别适用哪
一、基础知识
（一）固定化酶的 应用实例
总结：固定化酶技术的
优点：
•使酶既能与反应物接触， 又能与产物分离； •固定在载体上的酶可以 被反复利用。
在生产实际中使用固定化酶 技术有无不足?如有不足,怎么办?
有。一种酶只能催化一种化学 反应，而在生产实际中很多产 物的形成都通过一系列的酶促 反应才能进行，所以操作比较 麻烦。 可采用固定化细胞技术。
二、实验操作——酵母细胞的固定化
（1）酵母细胞的活化： 〖思考1〗活化是指什么？ 方法？
• 〖思考2〗在活化酵母的过 程中要注意？
1、酵母细胞活化时体积会变大， 所用容器要大一些，防止活化液溢出； 2、选用的干酵母有较强的活性且物种单一；
二、实验操作——酵母细胞的固定化
（1）酵母细胞的活化： （2）配制CaCl2溶液：
二、实验操作——酵母细胞的固定化
（1）酵母细胞的活化： （2）配制CaCl2溶液： （3）配制海藻酸钠溶液：
（4）海藻酸钠溶液与 酵母细胞的混合：
必须将溶化的海藻酸钠 溶液冷却至室温才能与 酵母细胞进行混合。 为什么？搅拌的目的？
二、实验操作——酵母细胞的固定化
（1）酵母细胞的活化：
•CaCl2溶液的作用？所形成的 凝胶柱在CaCl2溶液中浸泡的
2、下列关于酶和细胞的固定叙述 不正确的是( A)。 A．酶分子很小，易采用包埋法 B．酶分子很小，易采用化学结合 或物理吸附法固定的酶 C．细胞个大，难被吸附或结合 D．细胞易采用包埋法固定

–固定化研究开始于50年代,现在已经广泛应 用在近代工业微生物技术上;
实验原理
• 固定化技术生产啤酒
–固定化细胞能重复使用; –发酵后菌体与发酵液易于分离; –后处理工艺简单,成本低; –可连续发酵,过程自动化;
• 传统发酵法
–酵母细胞发酵一次即弃去菌体;
实验原理
• 包埋法
–固定化技术的一种; –将微生物细胞均匀的包埋在水不溶性载体
新鲜酸奶里含有大量的乳酸菌（每ml含40亿活菌以 上），可以使肠胃中的有益菌增加，抑制害菌成长，降 低毒素产生的机会，有利于改善便秘现象，因此能强化 肠胃消化吸收功能。
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酸奶的材料
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乳品 糖类
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–无菌玻璃棒; 可连续发酵,过程自动化;
固定化酵母细胞发酵啤酒实验 与酸奶制作 乳酸使乳蛋白更加细腻滑润、利于人体消化吸收，并能 使用保温杯（瓶）来制作酸奶 固定化细胞能重复使用;
–无菌封口膜封好的100ml三角瓶; 冷至40℃（不烫手）时，取市面上销售的酸奶一勺（约60克）掺入鲜奶中，摇匀。
9% 无菌生理盐水, 50ml; 使用保温杯（瓶）来制作酸奶

江苏省马坝高级中学高二生物导学案（选修1）编号04 班级姓名小组课题4酵母细胞的固定化【学习目标】1.说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。

2.尝试制作固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

【活动方案】活动一课题背景仔细阅读课题背景，想一想，我们如何能实现酶的固定化和细胞的固定化？酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。

实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。

设想:将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

固定化酶：优点既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用__实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成，都是通过一系例的酶促反应才能得到。

设想：能否将合成酶的细胞直接固定固定化细胞：优点成本更低，操作更容易活动二：固定化酶的应用实例1.如何利用固定化酶生产高果糖浆的？有哪些优点？高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆，能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。

使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。

酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。

生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱端流出。

反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

2．固定化酶的方式有哪些？活动三：固定化细胞技术1.给细胞固定酶和细胞固定化下个定义固定化酶与固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

2.细胞固定化的常用方法，包括_______________、__________________和_____________________法。

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。

将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。

用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。

并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。

采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。

关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。

固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作一．实验原理1.经过细胞固定化酵母菌被均匀包埋在载体结构中，加入麦芽汁，酵母菌将麦芽糖变成酒精。

2.在加糖的鲜牛奶中加入少量酸奶，利用酸奶中的乳酸菌进行发酵。

二．实验材料与试剂1.无菌滴管，无菌封口膜封好的100ml三角瓶2.发酵培养基：100ml8%—10%的麦芽汁装于250ml三角瓶中3. 2.5%的海藻酸钠溶液5ml，灭菌4.0.9%的无菌生理盐水，5ml5.无抗奶6.啤酒酵母7.市售原味酸奶，不经过灭菌三．实验步骤（一）固定化酵母细胞发酵啤酒1.菌体培养：将培养24h 的新鲜斜面菌种接种于三角瓶中培养。

2.细胞固定化：在预热至35℃的海藻酸钠溶液中加入2ml 预热至35℃的酵母培养液，混合均匀，以无菌滴管（离液面5cm以上）缓慢而稳定的加入CaCl2 溶液，即可得到直径约3mm左右的凝胶珠。

钙化30min。

注意无菌操作。

3.固定化细胞发酵啤酒：在无菌玻璃棒帮助下倒掉CaCl2 溶液，倒生理盐水于制得的固定化好的酵母细胞的瓶子中，洗一次凝胶珠。

将100mL发酵培养基（麦芽汁）倒入制得的固定化小球的瓶子中，用无菌封口膜封好瓶口。

20℃—28℃静置培养48h。

注意无菌操作。

4.品尝啤酒。

（二）制作酸奶1.分别取加热与不加热的溶有白糖的鲜牛奶分装到干净无菌的纸杯中，热牛奶用无菌封口膜封好瓶口，让其自然冷却（冷却中最好能摇晃三角瓶2—3次，以免乳脂结皮）。

2.热牛奶冷至40℃（不烫手）时，取市面上销售的酸奶倒入少许于鲜奶中（约5%），摇匀。

没有加热的牛奶直接加就可以。

3.用洁净的纸将杯口盖住，42℃进行发酵培养10—12小时。

牛奶变为不流动的酸奶时，停止发酵。

4.置于4℃冰箱中数小时，待冷却老熟后便成酸奶。

5.品尝酸奶。

四．实验结果啤酒不好喝，可能是因为只进行了前发酵，没有进行后发酵；酸奶味道很好，热牛奶做的感觉没有冷牛奶的酸。

五．实验讨论1.固定化技术的意义：固定化技术就是将生物酶或细胞固定在一定的基质上，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。