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实验七细菌运动力观察[实验目的]1、了解检查细菌运动力的方法。
2、掌握悬滴法检测细菌的运动力。
[实验原理]鞭毛是细菌的一种特殊结构，是细菌运动器官。
细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定中的重要特征之一。
采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法较复杂烦琐。
采用悬滴法或水封片法（压滴法）直接在光学显微镜下检查活菌是否具有运动能力来判断细菌是否具有鞭毛则快速、简便。
具有运动能力的细菌，可以独立运动，在显微镜下观察时，细菌的真正运动(自动运动)表现为能离开原来位置，不断改变方向的自由地游动。
水的分子运动(布朗运动)也能见于细菌个体，但只能使其在原地摆动，不能远离原来的位置移动。
这种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。
检查细菌的运动力，应用幼年培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下从速进行。
此外，这种方法也可用来检查微生物对各种化学物质的趋化性。
[实验材料]1、菌种2003Y1，2003Y2(为本实验室分离的菌种)的肉汤培养物2、仪器及其他物品显微镜、接种环、酒精灯、凹玻片、盖玻片、蒸馏水等[实验内容]1、悬滴检查法采用不染色活菌标本来检查其运动能力。
a.不染色标本片的制备取洁净盖玻片一张，用接种环各勾取蒸馏水1-2环于盖玻片四个角，灭菌接种环，再勾取2003Y1或2003Y2幼龄肉汤培养物1-2环于盖玻片中央；另取一干净凹玻片，凹面朝下对角扣于盖玻片上，再将玻片翻转，使菌液液滴向下，即可进行镜检。
若为固体培养物，则需在盖玻片中央先滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检固体培养物少量(不要过多)，混匀于液滴内即可。
盖玻片四角的蒸馏水起到粘附（使凹玻片和盖玻片紧密吸附）、防止液滴干燥的目的。
b. 镜检因细菌无色透明，与背景无明显的色差，故在观察时视野要稍暗。
10倍镜对光后调整光线使视野变暗。
放上悬滴标本片，先用低倍镜找到液滴边缘（因表面张力的作用，液滴边缘有大量的菌体，便于观察），然后再转换高倍镜对焦观察，一般不必使用油镜观察，必须用时，注意防止压坏盖玻片。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
细菌的运动性观察（一）实验原理细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。
采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。
如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。
此法较快速、简便。
悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。
水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。
大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。
有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。
1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。
2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。
3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
4.盖凹玻片将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。
若制水封片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。
5.镜检先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。
由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。
镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。
细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。
结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。
文案编辑词条B 添加义项?文案，原指放书的桌子，后来指在桌子上写字的人。
微生物实验报告——细菌鞭毛染色及活菌运动观察摘要关键词前言实验目的实验原理A.细菌鞭毛染色法的基本原理B.压滴法观察活菌运动的基本原理实验器材实验内容(一)压滴法观察活菌运动(二)细菌鞭毛染色实验结果参考文献报告编写人：张行润生命科学学院生科四班200900140177 细菌鞭毛染色及活菌运动观察摘要鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细茵的一项重要形态特征．细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0 . 01 ~0.02um ，所以，除了很少数能形成毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察．要用普通光学显微镜观查细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
细菌形态学观察包括细菌染色标本检查法和不染色标本检查法。
压滴法属于最常用的不染色标本检查法，主要用于检查细菌的运动性。
关键词鞭毛（flagellum）细菌（bacteria）鞭毛染色法（flagellum staining）光学显微镜（Optical microscope）压滴法（Pressure drop method）前言细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察。
但是由于设备限制，我们希望能够在普通的光学显微镜下就能够看见细菌鞭毛。
于是，便产生了鞭毛染色法。
1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。
试剂分为媒染剂和银染剂。
但是试剂的稳定性低，容易变质。
2002年谷海瀛发明了一种新的细菌鞭毛镀银染色法。
该法将媒染剂分为A、B两种。
A液为酸化FeCl3溶液，B液为15%单宁酸，含甲醛1 ml，用时A、B液等量混合，轻微加热，染片40s，再用银染液涂片加热至微冒蒸汽，染色10 s。
这种方法不仅染色效果好，而且解决了试剂稳定性差的问题，此种试剂常温下至少可保存1年。
细菌运动观察（二）
关键词：硝酸银菌种乙醇凡士林试剂标准物质北京标准物质网
一、操作步骤
1．鞭毛染色
1)硝酸银染色法
(1)菌种的准备：要求用活跃生长期菌种进行鞭毛染色和运动性的观察。
对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1～2次后使用。
为节约时间，从可行性角度出发，可选用下列方法(之一)接种培养作染色用菌种：①取新配制的营养琼脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28～32℃培养10～14h，取斜面和冷凝水交接处培养物作为染色观察材料；②取新制备的营养琼脂(含0．8％～1．0％的琼脂)平板，用接种环将新鲜菌种点种于平板中央。
28～32℃培养18～30h，让菌种扩散牛长，取菌落边缘的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作为染色观察的菌种材料。
注意：良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件。
不宜用已形成孢芽或衰亡期培养物作为鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
(2)载玻片的准备：将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
注意：玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片(将水滴在玻片上，无油迹玻片上的水能均匀散开)。
(3)菌液的制备：取斜而或平板菌种培养物数环于盛有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。
也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。
挑菌时，尽可能不带出培养基。
(4)制片：取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37℃温室)自然干燥。
载菌玻片千后，最好在0．5h内尽快染色，不宜长时间放置，以菌种免失活变性。
(5)染色：涂片干燥后，滴加硝酸银染色液甲液覆盖3～5min，用蒸馏水轻轻地充分洗去甲液。
用乙液冲去残水后，再加乙液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
若加乙液后显色较慢．可用微火加热(加热时不能出现干燥面)．直至显褐色时立即水洗，自然干燥。
注意：配制合格的染色剂(尤其是乙液)、充分洗去甲液后再加乙液、掌握好乙液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。
(6)镜检：染色载菌玻片干后用油镜观察。
观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端．有时只在涂片的指定部位观察到鞭毛。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形：
2)改良的莱弗氏染色法
(1)载玻片和菌种材料的准备：与硝酸银染色法相同。
(2)制片：用记号笔在载玻片反面将玻片分成3～4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌液。
将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。
室温或37℃温室自然干燥。
(3)染色：加莱弗氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数分钟后，加染液于第二区涂面，如此继续染第三、四区。
间隔时间自行议定，其目的是确定最佳染色时间。
在染色过程中，要仔细观察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗(不要先倾去染料再冲洗，否则背景不清)。
染色时间大约10min，自然干燥。
(4)镜检：载菌玻片染色干后用油镜观察，方法与硝酸银染色法相同。
菌体和鞭毛均呈红色。
2．运动性的观察
玻片的准备、菌种材料的准备与鞭毛染色法相同。
1)压滴法
(1)制片：在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0．01％的亚甲蓝水溶液与其混合均匀。
用镊子取一洁净盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢放下盖在菌液上。
观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压人小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运动。
(2)镜检：先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。
也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚度不能超过0．17mm。
观察时，要用略暗光线。
有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流动相区别。
2)悬滴法
(1)涂凡士林：取洁净凹载玻片(凹玻片)，在其凹槽四周涂少许凡士林[图2一13(a)]。
(2)加菌液：在盖玻片中央滴一小滴菌液。
为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌液周围画上记号。
菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央[图2—13(b)]。
(3)盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，并轻轻盖在盖玻片上。
轻轻按压使盖玻片与凹玻片黏合在一起，把液滴封闭在凹槽小室中，翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位于凹槽中央[图2—13(c)、(d)]。
若菌液加得过多，菌液就会流到凹玻片上而影响观察。
(4)镜检：先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。
若用油镜观察，盖玻片厚度不能超过0．17mn，，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损坏镜头。
观察过程要在略暗光线下进行。
二、实验报告
1．实验结果
所观察的3种细菌是否都有鞭毛?是否都能运动?鞭毛与运动有无相关性?绘图表示有鞭毛细菌的形态特征和运动特征。
2．思考题
(1)用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节?
(2)悬滴法为什么要涂凡士林?为什么加的菌液不能太多?如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，可能是什么原因造成的?
出处：北京标准物质网。
