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病毒的鸡胚培养法

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第二章 病毒的培养

第二章 病毒的培养

五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。

第二章鸡胚接种方法

第二章鸡胚接种方法

接种方法：
选 10 － 12 日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎 位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在 气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用 碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许， 开一小窗，勿损伤内层壳膜，经小窗向气室内滴入一 滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚 胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注 入0.1－0.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶 布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在 33℃、35℃或37℃的条件下孵育48－72小时。
3.绒毛尿囊膜接种 绒毛尿囊膜接种常常用于分离和繁殖在绒毛 尿囊膜上产生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、 单纯疱疹和鸟痘病毒。可在绒毛尿囊膜上滴 定这些病毒，因为感染性病毒颗粒的量可以 通过产生的斑和痘的数目来计算。还可用于 抗体滴定试验，因为斑和痘的个数减少的程 度与抗体浓度有关。
卵窗
定位：将胎盘部分
3、死胚蛋
头照可见血点、血线或血环紧贴内壳面， 血管色因氧化而比活胚深，有时散黄或有灰白 色凝块；中期死胚特征是气室界线模糊，胚胎 呈黑团状，常与壳粘连，不动，当手摇胚蛋时， 胚胎随之转动，停止摇晃时也随之停止。而活 胚时刻在活动；三照死胚的小头发亮，血管色 深，气室界线模糊，蛋体发凉；对尚未出壳的 也可用温水来判断将蛋放入40°C温水中，凡 是在水中轻微晃动的为活胚，反之则为死胚。
鸡胚接种技术
公共卫生学院 王德全
一、概况
1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养 研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。 1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚 繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次氏体。
近些年来由于组织培养技术和分 子生物学技术的发展，鸡胚培养 技术在某些方面已被其他技术所 取代，但是其在痘类病毒、粘液 病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、 制备抗原、疫苗生产以及病毒性 质等方面的研究上仍然是很重要 的。

标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法

标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法

一、目的流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。

本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。

三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。

实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。

H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。

其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。

实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。

其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。

（二）材料1．9～11日龄SPF 鸡胚2．照卵灯3．70%～75％酒精4．一次性注射器5．鸡蛋开孔器6．蜡或医用胶布7．液体石蜡8．15mL 无菌离心管、试管架标准操作规程（SOP ）——分离方法9．10mL无菌移液管10．无菌镊子。

（三）实验步骤1．验卵（1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。

（2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。

（3）如何判断鸡胚状态1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。

3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。

2．鸡胚接种（1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。

（2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。

（3）用注射器吸200µL处理过的临床标本，装上16号针头。

（4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。

新城疫病毒的鸡胚培养与病毒滴度检测课件

新城疫病毒的鸡胚培养与病毒滴度检测课件
• 尿囊腔接种： • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种： • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种： • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
实验九 新城疫病毒的鸡胚培养 与病毒滴度检测
一、目的要求
1. 掌握鸡胚接种的常规方法；背景知识介绍
1. 病毒的鸡胚培养
① 鸡胚是正在发育的活体：
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖，
尤其是禽类病毒。
④ 鸡胚接种的方法：
5. 封孔
• 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
6. 孵育与观察
• 气室朝上于37℃温箱中孵育； • 以后每天检卵1~2次。 • 弃去24h内的死亡鸡胚：
– 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；
四、实验内容
以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法： 1. 照胚：
取9~12日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置， 标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种： • 静脉接种
2. 新城疫病毒

鸡胚培养

鸡胚培养

病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, 入孵前0.1%新洁尔灭消毒表面. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的角度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除无精蛋和死胚蛋, 第九日起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释至效价为1:1280备用, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采用第9-10日龄的鸡胚, 进行尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出气室和大血管位置b 气室底边胚胎附近无大血管处标记注射位置c 气室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和气室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹角刺入3-5mm, 注射病毒液f 石蜡封口孵育: 气室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换气, 捡出24小时内死亡的鸡胚, 培养48小时, 搜集24小时以后死亡的鸡胚,收获: 48小时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1小时,避免收获时流血.气室端卵壳表面消毒, 镊子击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒毛尿囊膜, 吸出尿囊液和羊水, 无菌容器4℃保存待用. 同时可以取出鸡胚, 观察有无出血, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离心（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离心（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。

沉淀物用pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并用0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的血凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备用，临用前解冻病毒的鉴定:(1)血凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照生理盐水(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 生理盐水(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得血凝滴度.(2)毒力测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数生长期, 24小时前换培养液, 将所得到的病毒液倍比稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养皿,(小时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染力所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡血红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.石蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.无菌容器12.碘酒, 酒精, 镊子, 剪刀, 洗管, (打孔器)附:1.病毒血球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最高稀释倍数的病毒液0.25ml称为一个病毒血球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄生某寄主所需最小量病毒是0.1ml稀释至1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得血管小团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动无精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, 血管昏暗, 折断或飘落。

鸡胚接种实验报告

鸡胚接种实验报告

鸡胚接种实验报告引言鸡胚接种实验是一种常见的生物学实验，通过将病毒或细菌接种于鸡胚中，我们可以观察到它们对胚胎发育的影响。

这种实验能够帮助我们了解病原体的传播途径、感染机制以及鸡胚对外界刺激的响应能力。

本文将就鸡胚接种实验的过程和观察结果展开论述，以期更好地了解和探索生命的奥秘。

实验材料和方法材料：新鲜鸡胚、病毒/细菌培养液方法：1. 准备培养基：将培养基配制好，并加热灭菌。

2. 取出鸡胚：在无菌条件下，取出新鲜的鸡胚，约为8-10天，保证胚胎仍处于发育阶段。

3. 接种病原体：在鸡胚卵黄囊的顶部，用无菌针缓慢注入病原体培养液。

4. 封胚：用胶带或蜡封好孔洞，保持接种处的无菌状态。

5. 孵化：将接种后的鸡胚放入孵化器中，保持适当的温度和湿度。

6. 观察：根据实验设计，每隔一段时间观察鸡胚的发育情况。

实验结果通过观察病原体接种后的鸡胚，我们可以得出一些有趣的结果。

1. 反应变化：不同病原体对鸡胚的反应变化具有差异。

一些病原体可能导致胚胎发育减缓或停滞，而另一些病原体可能导致胚胎畸形或死亡。

这些结果提供了关于病原体对于胚胎发育的影响的线索。

2. 免疫响应：鸡胚对病原体的接种可能会触发免疫响应。

我们可以观察到鸡胚的免疫系统是否能够有效地对抗病原体的入侵。

免疫细胞的增多、炎症反应的出现都可能是这一免疫响应的体现。

3. 病变形态：观察鸡胚的病变形态对于了解病原体的感染机制和病变过程非常重要。

我们可以观察到病原体在鸡胚中的定位、侵入细胞的方式以及细胞破坏的情况。

这些观察结果有助于研究病原体的致病机制，并为预防和治疗提供依据。

4. 实验变量：在鸡胚接种实验中，还可以引入一些实验变量，比如改变接种浓度、不同时间点的接种等，以观察这些变量对实验结果的影响。

通过对变量的控制和对比，可以更加准确地判断病原体对鸡胚的影响。

结论鸡胚接种实验是一种有效的方法，可以研究病原体与胚胎发育之间的关系。

通过观察鸡胚的发育情况和病变形态，我们可以了解病原体的感染机制以及胚胎对外界刺激的响应能力。

鸡胚接种方法


检卵
在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到4－5天 后才容易看见。因此，检卵要在孵育4－5天 后进行。活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显， 上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显 的胚胎自主运动。如果胚胎活动呆滞或不能 自主运动，血管模糊、变细、折断脱落，绒 毛尿囊膜界线模糊，说明鸡胚已濒临死亡或 已经死亡。
及自然气室部分用铅 笔画出，在胎盘与蛋 白交界处（无血管区） 画一直径约1cm的等
边三角形。
绒毛尿囊膜
卵膜
气 室
羊膜腔
鸡 胚
卵黄囊 尿囊腔 卵 白
取卵壳：消毒后取下所画三角形区域的
卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺 一小口（不要伤及绒毛尿囊膜），
造人工气室：在自然气室部分用大注射
器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将 气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成 一“人工气室”
2.羊膜腔接种
羊膜腔接种主要用于从临床或现场材料 （如患者咽漱液等）中分离病毒。接种到 羊膜腔中的接种物能够被胚胎吞咽和进入 呼吸管，可遍及各种组织和细胞，使具有 特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用，从而 提高病毒繁殖的可能性。由于可收获的羊 膜组织或羊水较少，为了使病毒适应在尿 囊内胚层生长，从而获得大量的病毒，可 将经羊膜腔接种分离到的病毒再经尿囊腔 传代。
第5天
胚长1.0cm，胚重 0.13g，生殖腺已性 分化，组织学上可确 定胚的公母，胚极度 弯曲，整个胚胎成 “C”形，可见指（趾） 原基，眼的黑色素大 量沉着，照蛋时可明 显看到黑色的眼点， 俗称单珠或黑眼；
第6天
胚长1.38cm，胚重0.29g， 尿囊已达蛋壳膜内表面， 卵黄囊分布在蛋黄表面 的1/2以上，由于羊膜壁 上的平滑肌收缩，胚胎 有规律运动，蛋黄由于 蛋白水分的渗入而达到 最大重量，由约占蛋重 的30.01%增至65.48%， 喙原基出现，躯干部增 长，翅脚已可区分，照 蛋时，可见头部和增大 的躯干部两个小圆团， 俗称双珠；

1-3-2 实训 病毒的鸡胚培养技术


（三）材料和用具 白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架 、新城疫Ⅰ系和Ⅱ系弱毒苗等。
（四）实训准备 1．鸡胚骤
1．鸡胚的接种 （1）绒毛尿囊腔内注射取9～10日龄鸡胚，用锥子 在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端和气室下沿 无血管处各钻一小孔，针头从气室下沿小孔处插入 ，深1.5cm，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距 离，注射量约0.1～0.2mL。注射后以石蜡封闭小孔 ，置孵育箱中直立孵育。 （2）卵黄囊内注射取6～8日龄鸡胚，可从气室顶 侧接种(针头插入3～3.5cm)，因胚胎及卵黄囊位置 已定，也可从侧面钻孔，将针头插入卵黄囊接种。 侧面接种不易伤及鸡胚，但针头拔出后部分接种液 有时会外溢，需用酒精棉球擦去。其余同尿囊腔内 注射。 （3）绒毛尿囊膜接种。 （4）羊膜腔内接种所用鸡胚为10日龄，有两种方 法---开窗法 、盲刺法 。
（六）思考题 常用鸡胚接种方法有哪些? 鸡胚接种时应注意哪些事项?
2．接种后检查 3．鸡胚材料的收获 (1)绒毛尿囊腔内接种者用无菌手术去气 室顶壳，开口直径为整个气室区大小，以 无菌镊子撕去一部分蛋膜，撕破绒尿膜而 不撕破羊膜，用镊子轻轻按住胚胎，以无 菌吸管或消毒注射器吸取绒毛尿囊液置于 无菌试管中，多时可收获5～8mL，将收获 的材料低温保存。
(2)羊膜腔内接种首先收完绒毛尿囊液，后 用注射器带针头插人羊膜腔内收集，约可 收到1mL液体，无菌检查合格保存。 (3)卵黄囊内接种者，先收掉绒毛尿囊液和 羊膜腔液，后用吸管吸卵黄液，无菌检查 同上。将整个内容物倾人无菌平皿中，剪 取卵黄膜保存，若要做卵黄囊膜涂片时， 可此时进行。
实训 病毒的鸡胚培养技术
（一）实训目的
掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的 接种途径和接种方法。

鸡胚繁殖病毒技术


一、鸡胚的选择
• 1、冻干苗应选择受精率比较高的（90%以 上）SPF种鸡蛋，鸡蛋必须新鲜、洁净。原 因是SPF种鸡蛋不携带致病微生物，生产出 来的疫苗更安全。SPF种鸡蛋没有干扰病毒 增殖的母源抗体，与普通种蛋相比能明显 提高病毒含量。 • 2、灭活苗可以选择受精率比较高的（90% 以上）普通低免疫蛋，好处就无菌检验： • 收获的病毒液如果用于冻干苗的生产要逐瓶进行 无菌检验。 • 检验方法：先准备好检验培养基每套2支酪胨琼脂 和2支硫乙醇酸盐，将培养基与收获的病毒液对应 编号，每瓶病毒液用灭菌的注射器抽取2ml左右， 每支加入0.5ml左右，盖好塞后分别放入37℃和 25℃培养箱中培养，5天后观察结果，固体培养 基斜面上有菌生长、液体培养基变浑浊的判为污 染，应弃去不用。
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
1、接种方法：
• 根据不同的病毒（或其他微生物）选择不 同的接种方法。包括尿囊腔接种、绒毛尿 囊膜接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、静 脉接种、脑内接种等。
• 其中最常用的方法是尿囊腔接种，方法是 取9～10日龄鸡胚，画出气室范围，离气室 边缘0.3～0.5mm无大血管处做一个记号， 作为接种孔的位置。先用5%的碘酊消毒， 15分钟后用75%的酒精脱碘，然后用消毒 的锥子在记号处打一个小孔，用1ml注射器 的针头刺入0.5～1cm，注入种毒，用白蜡 封口。接种后继续孵化，一般温度设定为 37℃左右，相对湿度设定为70%～90%， 继续孵化2～7天，不必翻蛋。

IBV的鸡胚培养

IBV的鸡胚接种和培养规程一．实验材料鸡胚：选用健康无病鸡群或ＳＰＦ鸡群的新鲜受精蛋，一般选白或浅色壳蛋，以便照蛋时清晰，孵化至９～１０日龄。

1.接种材料：ＩＢＶ病毒液或组织病样，需要保证无菌处理。

2.器械：孵化箱、照蛋灯、蛋架、锥子、１ｍｌ和２.５ｍｌ注射器、镊子、２%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、灭菌的疫苗瓶、蜡烛、铜筛网、０.２２μｍ过滤器。

二、实验步骤１、鸡胚的孵化打扫孵育箱：清理孵育箱中的垃圾，换掉脏水，用０.１％的新洁尔清洗蛋架、擦拭孵育箱各处。

用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒：甲醛毫升数与高锰酸钾克数之比为2:1。

福尔马林30mL/立方米，高锰酸钾15克/立方米。

先用少量温水将高锰酸钾在玻璃容器中溶解，再加入福尔马林，人即离开，密闭箱门。

熏蒸12~24h后再开启箱门。

孵化：条件相对湿度６０％，温度３７.５℃，每日翻蛋至少３次。

孵化３～４天，用照蛋器观察：发育正常的鸡胚，血管清晰主要的分枝明显且呈鲜红色，鸡胚可以活动；未受精的蛋及时检出，死胚固定一端不动，看不到血管或血管消散，应检出。

２.病毒接种材料的处理病毒液：怀疑污染细菌的病毒液，经过滤器无菌过滤组织病样：剪碎→研磨→２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ→取上清→过滤３.照蛋：以铅笔划出气室，胚胎头的位置４.打扫无菌间：地面拖干净，桌面用０.１％的新洁尔擦拭干净，紫外照射２０ｍｉｎ。

５.打孔：以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，用锥子在酒精灯火焰灼烧消毒后，在气室下沿无血管处扎一小孔。

６.接种：针头从气室下沿小孔处插入，深１.５ｃｍ，即已穿过了外壳膜且距离胚胎有半指距离，注射量约０.２ｍＬ。

注射后以蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育，6小时后可以横放，以便翻蛋。

７.接种后检查：每天翻蛋3-4次，照视1-2次，24小时内死亡的舍去。

８.收获：接种后36-72 h收获。

其中36-48小时的留种毒较好。

收获前将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂；碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，取小块铜筛网置于酒精灯上灼烧灭菌，冷却后放在打开的尿囊腔中，用２.５ｍＬ注射器吸取尿囊液（大约可收集５～８ｍＬ）。

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（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用