病毒的鸡胚培养

病毒的鸡胚培养一、目的掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理二、实验内容1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。

15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。

每2小时翻番一次。

2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。

于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。

3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。

每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。

至120h全部取出于4℃冰箱过夜。

4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。

5、HA效价测定：原理。

1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。

血凝试验按下表操作。

病毒鸡胚培养病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。

鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。

目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。

除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。

[目的要求](1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。

(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。

[实验材料]白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。

[实验准备]1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。

用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。

孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。

篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。

鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。

根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。

本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。

特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。

将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。

若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。

也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。

2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。

死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。

病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。

仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。

方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。

选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。

孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。

每日最少翻蛋3次。

健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。

2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。

3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。

4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。

6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。

7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。

孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。

弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。

8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。

（2）接种什么部位，收集什么部位。

（3）固液分开收集。

（4）无菌收集。

（5）冷冻保存。

收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。

病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。

通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。

本文将介绍几种常见的病毒培养方法。

一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。

病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。

这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。

通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。

二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。

在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。

通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。

三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。

科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。

通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。

然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。

四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。

通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。

这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。

然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。

总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。

不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。

鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。

鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。

根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。

本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。

特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。

将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。

若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。

也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。

2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。

死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。

3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

实验五十一动物病毒的鸡胚培养三、器材1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。

2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。

3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。

四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。

孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。

活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。

生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。

2.接种（1）绒毛尿囊膜接种①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。

②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。

在气室顶端钻一小孔。

③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。

④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。

⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。

鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。

2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。

3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。

接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。

4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。

5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。

同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。

6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。

收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。

7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。

需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。

同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。

IBV的鸡胚接种和培养规程
一．实验材料
鸡胚：选用健康无病鸡群或ＳＰＦ鸡群的新鲜受精蛋，一般选白或浅色壳蛋，以便照蛋时清晰，孵化至９～１０日龄。

1. 接种材料：ＩＢＶ病毒液或组织病样，需要保证无菌处理。

2. 器械：孵化箱、照蛋灯、蛋架、锥子、１ｍｌ和２.５ｍｌ注射器、镊
子、２%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、灭菌的疫苗瓶、蜡烛、铜筛网、０.２２μｍ过滤器。

二、实验步骤
１、鸡胚的孵化
打扫孵育箱：清理孵育箱中的垃圾，换掉脏水，用０.１％的新洁尔清洗蛋架、擦拭孵育箱各处。

用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒：甲醛毫升数与高锰酸钾克数之比为2:1。

福尔马林30mL/立方米，高锰酸钾15克/立方米。

先用少量温水将高锰酸钾在玻璃容器中溶解，再加入福尔马林，人即离开，密闭箱门。

熏蒸12~24h后再开启箱门。

孵化：条件相对湿度６０％，温度３７.５℃，每日翻蛋至少３次。

孵化３～４天，用照蛋器观察：发育正常的鸡胚，血管清晰主要的分枝明显且呈鲜红色，鸡胚可以活动；未受精的蛋及时检出，死胚固定一端不动，看不到血管或血管消散，应检出。

２.病毒接种材料的处理
病毒液：怀疑污染细菌的病毒液，经过滤器无菌过滤
组织病样：剪碎→研磨→２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ→取上 1。

一、实习背景鸡胚培养是生物技术领域的一项重要技术，广泛应用于病毒学、免疫学、遗传学等研究领域。

通过在鸡胚中培养病毒，可以研究病毒的复制、传播机制以及疫苗的研发等。

为了提高自身对鸡胚培养技术的掌握，我参加了为期两周的鸡胚培养实习。

二、实习目的1. 熟悉鸡胚培养的基本原理和操作流程。

2. 掌握鸡胚接种、传代、观察等实验技术。

3. 了解鸡胚培养在病毒学研究中的应用。

三、实习内容1. 鸡胚培养基本原理鸡胚培养是利用鸡胚作为宿主，在适宜的条件下，使病毒在其中复制、增殖，从而达到研究病毒的目的。

鸡胚具有以下优点：（1）繁殖速度快，易于操作。

（2）病毒在鸡胚中生长条件稳定，有利于病毒学研究。

（3）鸡胚具有广泛的病毒易感性，可以用于多种病毒的研究。

2. 鸡胚培养操作流程（1）鸡胚选择：选择健康的鸡胚，一般选用9-14天的鸡胚。

（2）鸡胚消毒：将鸡胚置于75%酒精中浸泡30秒，然后用无菌生理盐水冲洗。

（3）接种：将病毒悬液滴加于鸡胚尿囊腔中，每只鸡胚接种量为0.2-0.5ml。

（4）孵育：将接种后的鸡胚置于37℃恒温箱中孵育，观察病毒生长情况。

（5）观察：定期观察鸡胚的生长状况，记录病毒复制情况。

（6）收获：当鸡胚出现病变时，收集尿囊液，进行病毒分离、鉴定等实验。

3. 鸡胚培养在病毒学研究中的应用（1）病毒分离：利用鸡胚培养可以分离出多种病毒，如流感病毒、新城疫病毒等。

（2）病毒鉴定：通过鸡胚培养可以观察病毒的形态、生长特性等，从而对病毒进行鉴定。

（3）病毒疫苗研发：利用鸡胚培养可以筛选出具有免疫原性的病毒抗原，为疫苗研发提供依据。

四、实习收获1. 熟悉了鸡胚培养的基本原理和操作流程，掌握了鸡胚接种、传代、观察等实验技术。

2. 深入了解了鸡胚培养在病毒学研究中的应用，提高了自己的科研能力。

3. 通过实习，培养了严谨、细致的科研态度，提高了自己的动手能力。

五、实习总结本次鸡胚培养实习让我受益匪浅。

在实习过程中，我不仅学到了鸡胚培养的基本知识和操作技能，还了解了鸡胚培养在病毒学研究中的应用。

实验五十一动物病毒的鸡胚培养三、器材1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。

2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。

3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。

四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。

孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。

活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。

生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。

2.接种（1）绒毛尿囊膜接种①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。

②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。

在气室顶端钻一小孔。

③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。

④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。

⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。

鸡胚培养病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, ⼊孵前0.1%新洁尔灭消毒表⾯. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的⾓度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除⽆精蛋和死胚蛋, 第九⽇起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释⾄效价为1:1280备⽤, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采⽤第9-10⽇龄的鸡胚, 进⾏尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出⽓室和⼤⾎管位置b ⽓室底边胚胎附近⽆⼤⾎管处标记注射位置c ⽓室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和⽓室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹⾓刺⼊3-5mm, 注射病毒液f ⽯蜡封⼝孵育: ⽓室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换⽓, 捡出24⼩时内死亡的鸡胚, 培养48⼩时, 搜集24⼩时以后死亡的鸡胚,收获: 48⼩时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1⼩时,避免收获时流⾎.⽓室端卵壳表⾯消毒, 镊⼦击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒⽑尿囊膜, 吸出尿囊液和⽺⽔, ⽆菌容器4℃保存待⽤. 同时可以取出鸡胚, 观察有⽆出⾎, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离⼼（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离⼼（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。

沉淀物⽤pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并⽤0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的⾎凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备⽤，临⽤前解冻病毒的鉴定:(1)⾎凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照⽣理盐⽔(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25⽣理盐⽔(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得⾎凝滴度.(2)毒⼒测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数⽣长期, 24⼩时前换培养液, 将所得到的病毒液倍⽐稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养⽫,(⼩时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染⼒所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡⾎红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.⽯蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.⽆菌容器12.碘酒, 酒精, 镊⼦, 剪⼑, 洗管, (打孔器)附:1.病毒⾎球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最⾼稀释倍数的病毒液0.25ml称为⼀个病毒⾎球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄⽣某寄主所需最⼩量病毒是0.1ml稀释⾄1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得⾎管⼩团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动⽆精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, ⾎管昏暗, 折断或飘落。