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鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养第⼀节鸡胚接种⼀、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多⼈类和动物病毒的⽣长增殖，是常⽤的病毒分离培养⽅法之⼀（⾐原体、⽴克次体的分离亦⽤鸡胚）。
⽬前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应⽤较多。
可⽤于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再⽤鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是⼀种不可缺少的培养⼿段。
鸡胚培养的优点是，来源充⾜，价格低廉，操作简单，⽆需特殊设备或条件，易感病毒谱较⼴，对接种的病毒不产⽣抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需⽤第⼆试验系统来测定病毒存在与否；⾮ SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚⾄还可能带有鸡⽩痢沙门⽒菌、霉形体、鸡⽩⾎病等病毒。
因此，⽤鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使⽤⾮免疫蛋来孵鸡胚，最好⽤ SPF 鸡胚。
⼀般说来，孵育⾄ 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的⽣长，因为此阶段鸡胚发育⽇趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，⾻胳不健全，还未长出⽻⽑，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获⾼滴度的病毒，14 天以后，胚胎⾻骼硬化，胚⽪表⾯⽻⽑渐⽣，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）⼀定要注意到这⼀点。
孵育⾄ 21 天左右，⽺⽔和尿囊液已全部被胚胎吸收，⼀部分卵黄陷⼊胚胎腹部，另⼀部分则仍留在体外，胚胎已发育成⼩鸡，破壳⽽出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为⽯灰质的卵壳，上有⽓孔供⽓体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使⽓体分⼦与胚胎内的液体分⼦在内外进⾏交换，因此在孵育时需要有⼀定的湿度和空⽓。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱⽔、引起鸡胚死亡。
⽓流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。
置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
剪去头部、翅爪及脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。
